王天山，何春剛，文俏慧，劉沛銘，楊 媚

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

苯甲酸型芳香小分子廣泛存在于藥用植物與食用真菌中，是一類常見的天然物質(zhì)，具有重要的生理作用和生物活性；是多種藥用植物的抗腫瘤活性部位的主要化學(xué)成分，也是多種中藥揮發(fā)油的主要化學(xué)成分[1-6]。其作為植物的次生代謝產(chǎn)物，普遍認(rèn)為是經(jīng)過苯丙氨酸途徑合成的，與木脂素類和黃酮類化合物是同根同源的[7]。到目前為止，尚未有文獻(xiàn)系統(tǒng)地報道這類芳香小分子的電噴霧多級質(zhì)譜的裂解途徑及其規(guī)律。本研究所選擇的11種苯甲酸型芳香小分子化合物有羧酸，酯類和醛類，在苯環(huán)的間位和/或?qū)ξ挥?至3個羥基和/或甲氧基，是具有代表性的天然源的化合物。采用三重四級桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜分析，通過解析碎片離子的結(jié)構(gòu)及裂解順序，總結(jié)該類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可為該類化合物的結(jié)構(gòu)分析和快速鑒定提供數(shù)據(jù)依據(jù)，也為研究其他同源的擁有相似結(jié)構(gòu)單元的木脂素類和黃酮類化合物質(zhì)譜裂解提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

實驗儀器：Esquire HCT 型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；FA1604型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）。

沒食子酸三甲醚，自制；丁香酸，上海生工生物公司；香草酸、異香草酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯、異香蘭素、對羥基苯甲醛，上海阿拉丁公司；丁香醛，分離純化于藥用植物香花暗羅；香蘭素，自制；HPLC級甲醇，上海MACRON精細(xì)化工公司。

1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離離子源（ESI），采用ESI正離子和負(fù)離子掃描模式；掃描范圍為m/z 50～300；掃描方式：自動一級質(zhì)譜全掃描，手動多級質(zhì)譜提取離子掃描；毛細(xì)管電壓為104 Volt；掃描速度26000 m/z；樣品通過蠕動泵以4 μL/min的速率送入離子源；噴霧電壓3500 V；干燥氣N2溫度為300 ℃；流速8 L/min；霧化氣N2壓力為6.9×104Pa；引入少量氦氣（約5.0×105Pa）作為多級質(zhì)譜的碰撞氣，同時可以提高離子的誘捕效率；多級質(zhì)譜的碰撞能量為0.8 V。進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣；采用四舍五入法將離子的質(zhì)荷比歸整。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧酸類化合物的多級質(zhì)譜裂解

選擇5種苯甲酸衍生物作為研究對象，分別是沒食子酸三甲醚（1）、丁香酸（2）、香草酸（3）、異香草酸（4）和對羥基苯甲酸（5）。在自然界中，苯甲酸的衍生物多被羥基及甲氧基取代，取代在苯甲酸的間位和對位，其中沒食子酸三甲醚和丁香酸是在苯甲酸的間位和對位有3個取代基，而香草酸、異香草酸和對羥基苯甲酸在間位和對位有兩個取代基。通過研究上述羧酸的多級質(zhì)譜裂解碎片，闡述羧基及苯環(huán)上的取代基裂解的順序及中性小分子或自由基的形式（表1）。

表1 羧酸類化合物1～5多級質(zhì)譜裂解碎片Table 1 MSn fragment ions of acids 1～5

2.1.1 正離子[M+H]+模式羧酸的裂解途徑

由質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，沒食子酸三甲醚和丁香酸這兩種化合物總體存在兩條裂解途徑。第一條途徑是先在-COOH上脫去CO2得到三取代苯與H+加合正離子，接下來是斷裂取代基，在取代基中較優(yōu)先斷裂的是從甲氧基丟失甲基自由基。第二條途徑是羧基與加合H+離子脫水生成?；x子或者直接脫羥基生成羧酸正離子。

沒食子酸三甲醚的苯環(huán)上的間位和對位取代基均為甲氧基，其經(jīng)過脫CO2和依次丟失三個甲基自由基（m/z 169，154和139）后，由酚式結(jié)構(gòu)經(jīng)烯醇式-酮式互變異構(gòu)形成鄰苯二醌的結(jié)構(gòu)（m/z 124）。丁香酸的結(jié)構(gòu)與沒食子酸三甲醚相似，分析其二級碎片離子發(fā)現(xiàn)有[M+H-17]+（m/z 182）的二級碎片離子，對應(yīng)的是丟失對位羥基自由基，然后加合離子H+遷移至對位形成間位二甲氧基苯甲酸正離子；另外一種方式是按照途徑一得到的鄰二酚離子m/z140再脫OH自由基（m/z 123）后苯環(huán)縮環(huán)裂解（m/z 95）（圖1）。

圖1 化合物1和2在[M+H]+模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 1 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M+H]+mode

在化合物3～5中也存在與化合物1和2相似的裂解規(guī)律，即優(yōu)先脫羧，脫水和脫羥基等中性小分子和自由基（圖2）。采用多級碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)掃描香草酸和異香草酸的二級離子[M+H-CO2]+（m/z 125），發(fā)現(xiàn)有[M+H-CO2-14]+的三級子離子生成，對應(yīng)于裂解掉一個CH2碎片；其可能的裂解方式是當(dāng)甲氧基的鄰位未被取代時，甲氧基上的氫經(jīng)五中心過渡態(tài)遷移至鄰位，斷掉亞甲基的同時生成酮式結(jié)構(gòu)；由于該酮式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，隨即發(fā)生酮式-烯醇互變異構(gòu)恢復(fù)芳香體系生成酚式結(jié)構(gòu)（m/z 111）。

2.1.2 負(fù)離子[M-H]-模式羧酸的裂解途徑

圖2 化合物3-5在[M+H]+模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 2 Fragmentation pathway of 3-5 in[M+H]+mode

在負(fù)離子[M-H]-模式下，發(fā)現(xiàn)這5種苯甲酸類化合物有一種相同的裂解方式，先是脫CO2再斷掉苯環(huán)上的甲基，另外也出現(xiàn)先斷苯環(huán)上的甲基再脫CO2的過程，這兩種過程都生成多取代苯酚負(fù)離子[M-H-59]-（圖3、圖4）。還發(fā)現(xiàn)化合物1有一個碎片離子比母離子m/z 196少了57 Da（[M-H-CH3-57]-），這可能是經(jīng)過斷掉甲基后發(fā)生縮環(huán)反應(yīng)丟失C2O2H單元，生成二取代環(huán)戊二烯酮負(fù)離子m/z 139。化合物1經(jīng)脫羧后，接下來再失去苯環(huán)上的甲基或者亞甲基，生成醌式（m/z 137）或者酚式負(fù)離子（m/z 153和123）。

圖3 化合物1和2在[M-H]-模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 3 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M-H]-mode

圖4 化合物3-5在[M-H]-模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 4 Fragmentation pathway of 3-5 in[M-H]-mode

2.2 酯類化合物的多級質(zhì)譜裂解

香草酸甲酯（6）和對羥基苯甲酸甲酯（7）同是苯甲酸甲酯的衍生物，在間位和對位均有供電子基羥基和甲氧基。研究這兩種化合物的多級質(zhì)譜，以便獲得酯基的開裂方式和苯環(huán)上的羥基和甲氧基裂解的順序（表2）。

2.2.1 正離子[M+H]+模式酯的裂解途徑

在[M+H]+模式下，芳香酯類化合物首先在酯基上發(fā)生裂解，斷掉CH3OH和CO2的中性小分子，或者斷掉CO2CH3自由基。該酯類化合物的酯基是經(jīng)過三中心骨架重排使甲基遷移至苯環(huán)上的同時脫掉CO2分子，生成[M+H-CO2]+的甲苯型碎片離子，接下來斷掉該甲基生成酚正離子，其結(jié)果與直接斷掉CO2CH3自由基生成[M+H-59]+的碎片離子一樣。另外，化合物6和7還存在[M+H-32]+的碎片離子，提示斷掉1分子CH3OH生成苯甲酰基正離子；其中7 的苯環(huán)上沒有OCH3，說明丟失的CH3OH 碎片來自酯基中的-OCH3和加合H+離子。該[M+H-32]+苯甲?；x子再依次從苯環(huán)上斷掉甲基和羥基自由基?；衔?的m/z 136離子生成m/z 124的碎片離子是經(jīng)過苯環(huán)縮環(huán)丟失一個CHO自由基，化合物7的?；x子m/z 121在苯環(huán)上脫水生成苯炔類正離子m/z 103（圖5）。

表2 酯類化合物6和7的多級質(zhì)譜裂解碎片Table 2 MSn fragment ions of esters 6 and 7

圖5 酯類化合物在[M+H]+模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 5 Fragmentation pathway of esters in[M+H]+mode

2.2.2 負(fù)離子[M-H]-模式酯的裂解途徑

在負(fù)離子[M-H]-模式，酯類化合物在間位和對位存在羥基和甲氧基時，優(yōu)先斷裂的是酯基。酯類化合物常見的是先脫甲基自由基再脫羧。脫羧有兩種形式，即脫-CO2H自由基和脫CO2分子。化合物6在MS2-3中分別觀察到2個子離子依次減少15Da的離子為m/z 166和151，提示依次失去分子中的兩個-CH3。化合物7 的酯基還出現(xiàn)了先經(jīng)過三中心甲氧基重排脫去CO，生成比準(zhǔn)分子離子m/z 151 少28Da 的碎片負(fù)離子m/z 123，該負(fù)離子再丟失1個甲基自由基生成對苯二醌負(fù)離子m/z 108。此外，還發(fā)現(xiàn)化合物7在酯基上脫CH2得到m/z 137，可能是按照五元環(huán)重排使甲基上的1個H遷移到CO的氧原子上而使CH2自由基斷裂（圖6）。

2.3 醛類化合物的多級質(zhì)譜裂解

醛類化合物的結(jié)構(gòu)與羧酸類和酯類化合物的結(jié)構(gòu)相似，天然源的苯甲醛類衍生物的取代基集中在間位和對位，也是以羥基和甲氧基為主。以丁香醛（8）、香蘭素（9）、異香蘭素（10）和對羥基苯甲醛（11）為例，采用CID技術(shù)分別掃描準(zhǔn)分子離子峰（[M+H]+和[M-H]-）和一些重要的碎片離子，得到的主要多級質(zhì)譜裂解碎片列于表3。

圖6 酯類化合物在[M-H]-模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 6 Fragmentation pathway of esters in[M-H]-mode

表3 醛類化合物8～11的多級質(zhì)譜裂解碎片Table 3 MSn fragment ions of aldehydes 8～11

2.3.1 正離子[M+H]+模式醛的裂解途徑

在正離子[M+H]+模式，醛類化合物都一致優(yōu)先從醛基上脫去1分子CO，得到比準(zhǔn)分子離子少28Da的對應(yīng)的酚醚類加合離子。接下來是斷裂苯環(huán)上的甲氧基和羥基，并且甲氧基優(yōu)先于羥基斷裂；甲氧基可以斷掉甲基自由基-CH3（8）和亞甲基-CH2-（9和10），也可以斷掉甲氧基和甲醇分子的（8）。如果苯環(huán)上只有羥基的，就直接把羥基質(zhì)子化而脫掉一個水分子（10和11）。最后是苯環(huán)的裂解，常見的也是脫去中性分子CO和自由基CHO（8和10）（圖7）。

2.3.2 負(fù)離子[M-H]-模式醛的裂解途徑

醛類化合物在負(fù)離子[M-H]-模式下的裂解方式較為多樣化。其基本裂解規(guī)律是從醛基上脫CO 或者CHO自由基，比如化合物11在二級譜中由準(zhǔn)分子離子m/z 121分別生成m/z 92和m/z 93的子離子；當(dāng)苯環(huán)上有甲氧基時，則優(yōu)先斷裂掉甲基自由基生成醌負(fù)離子（化合物8依次斷掉2個甲基分別生成m/z 166和151的醌負(fù)離子），或者斷裂掉亞甲基自由基生成酚負(fù)離子（化合物10斷掉亞甲生成m/z 137的酚負(fù)離子）；接下來醌負(fù)離子和酚負(fù)離子再從醛基上脫CO（圖8）。

圖7 醛類化合物在[M+H]+模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 7 Fragmentation pathway of aldehydes in[M+H]+mode

圖8 醛類化合物在[M-H]-模式下的多級質(zhì)譜裂解Figure 8 Fragmentation pathway of aldehydes in[M-H]-mode

3 結(jié)論

選擇研究了11種苯甲酸型芳香小分子的電噴霧多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過分析碎片離子裂解的先后順序，總結(jié)出該類型化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物在電噴霧質(zhì)譜中裂解優(yōu)先發(fā)生在主要的官能團(tuán)，即羧基，酯基和醛基。第二階段是脫去苯環(huán)上的取代基，主要是甲氧基和羥基，由于氧與苯環(huán)的p-π共軛效應(yīng)使得C-O比較牢固，因此取代基的斷裂優(yōu)先從甲氧基上脫去甲基；當(dāng)甲氧基的鄰位未被取代時，常觀察到從甲氧基經(jīng)重排反應(yīng)后丟失亞甲基，這一過程可能是經(jīng)過五元環(huán)氫遷移到鄰位得到酮式結(jié)構(gòu)，該酮式結(jié)構(gòu)再恢復(fù)芳香體系得到酚式結(jié)構(gòu)。最后是苯環(huán)的裂解，常見的是發(fā)生縮環(huán)反應(yīng)脫去CO或者CHO自由基。