3種取材法檢測尖銳濕疣皮損中人乳頭瘤病毒及亞型分布的對比研究

胡雯，康曉靜

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）臨床表現(xiàn)為局部皮膚或黏膜出現(xiàn)良性疣狀增生及贅生性皮損，由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染的一種性傳播疾病[1-3]。尖銳濕疣生長迅速，具有高復發(fā)性及傳染性[4,5]，還存在不易察覺的亞臨床感染狀態(tài)，較難治愈，不僅給患者及其家屬帶來精神上和經(jīng)濟上的沉重負擔，而且嚴重影響患者的身體健康。不同的HPV 型別在一定程度上決定了其感染部位、組織病理特征、臨床表現(xiàn)及相應病程[6-8]。本文對新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科就診的尖銳濕疣患者采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測HPV 感染，并對比研究了3種取材方法的檢出率，有助于了解相關HPV 病毒亞型在尖銳濕疣患者中的分布，對尖銳濕疣患者的準確診斷、治療效果、預防等具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料來源收集新疆烏魯木齊地區(qū)2016年12月—2018年6月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科門診就診的277例尖銳濕疣患者上皮細胞和組織標本。277例患者中男207例，女70例，漢族患者228例，維族患者49例，年齡19～81歲，平均年齡34.53歲，其中＜20歲20例，20～29歲112例，30～39歲53 例，40～49歲55 例，50～59歲26 例，＞60歲11例，并對277例患者標本進行了HPV 分型檢測。

1.1.2 儀器與試劑HPV 基因分型檢測試劑盒(潮州凱普生物化學有限公司)，可同時檢測23 種基因型，包括16 種高危型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82）和7 種低危型（HPV6、11、42、43、44、53、81）。實時熒光定量PCR 擴增儀Rotor-Gen 5 Plex+HRM（南京愛楷能生物科技有限公司），生物安全柜BHC-1300IIA2[阿爾泰實驗室設備（北京）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 ①刮取法：刮取女性宮頸上皮細胞（男性生殖道分泌物），用無菌棉拭子在女性宮頸（男性尿道口內(nèi)）取分泌物置無菌管中送檢；②疣體涂擦法：用一次性注射器將疣體刺破后，再用棉拭子反復擦拭病灶處以獲得足量的脫落細胞；③疣體微創(chuàng)采集法：將確認的疣體表面擦洗干凈，應用眼科活檢鑷從疣體組織中取體積1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 組織標本，置1.0 ml無菌生理鹽水中送檢。

1.2.2 HP NA提取按HPV分型檢測試劑盒說明書步驟操作提取DNA模板。其中，凱普一步法核酸提取試劑盒提取宮頸和尿道口以及疣體表面脫落細胞標本DNA；凱普三步法核酸提取試劑盒提取組織標本DNA。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測本研究基于多重熒光PCR技術，通過實時熒光PCR儀，進行同步核酸擴增與檢測。分成6個反應管，通過儀器4種熒光檢測通道，從而對23種HPV基因型進行分型檢測，及對細胞內(nèi)對照β-globi NA檢測。細胞內(nèi)對照DNA用于評估樣本質(zhì)量及PCR抑制因素。

1.2.4 結果判斷檢測結果判斷嚴格按照試劑盒說明書。樣本的Ct值顯示為Undet，判斷為陰性；樣本的Ct值≤40，判斷為陽性；若為40＜Ct值＜45的樣本建議重做，重做結果Ct值＜40者為陽性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染情況及基因型分布

277例標本中HPV 檢測陽性者219例，陽性率為79.06%。陽性率居前4位的HPV 亞型分別為HPV6型（90/219）、11型（12/219）、16型（12/219）、42型（3/219），維漢以及男女患者之間HPV 陽性檢出率相比差異均無統(tǒng)計學意義。HPV 感染主要是單一感染，多重感染則主要見于二重感染，其中，男、女患者二重感染差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.675，P＜0.05），見表1。

表1 HPV陽性尖銳濕疣患者亞型分布

2.2 各年齡段HPV 感染情況

檢出的219例陽性標本中，單一感染陽性率高于多重感染陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。單一HPV 感染者為140例（50.54%），多重HPV 感染者79例（28.52%）。20～29歲組陽性率最高，為86.23%，其次30～39歲和40～49歲的陽性率分別為83.01%和76.36%，見表2。

表2各年齡段HPV感染分布情況[n(%)]

2.3 3種不同方法取材檢測結果

用刮取分泌物法、疣體涂擦法和微創(chuàng)取疣體新鮮組織3種方法對HPV 檢出率分別為75.78%、76.15%和92.86%，其中刮取法與涂擦法HPV 檢出率相比差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.327，P＞0.05），刮取法和涂擦法與微創(chuàng)法對HPV 檢出率相比差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.004，P＜0.05；χ2=5.456，P＜0.05），見表3。

表3 3種方法取材檢測HPV-DNA的結果比較

3 討論

尖銳濕疣臨床表現(xiàn)為局部皮膚或黏膜出現(xiàn)良性疣狀增生及贅生性皮損，其潛伏期通常平均3個月左右，短者3周，長者＞6個月。本病流行于全世界，是目前歐美及非洲國家最常見的性傳播疾?。⊿TD）之一[6]。尖銳濕疣在我國的發(fā)病率較高，近年迅速增加，給患者及其家屬帶來精神上和經(jīng)濟上的沉重負擔[7]，具有嚴重的社會危害性，成為僅次于淋病的第二大性傳播疾病[8]。尖銳濕疣與HPV 感染有關，目前已知的HPV 類型有200多種，其中有40余種亞型可經(jīng)性接觸感染泌尿生殖道，導致尖銳濕疣等皮膚病變。

在本研究中所采用的實時熒光定量PCR 檢測HP NA 可以鑒定感染的HPV 具體型別以及多型別的混合感染，該檢測方法特異性強、靈敏度高，且不受樣本純度、樣本是否存活及樣本類型等方面的影響，從而解決不易培養(yǎng)微生物的鑒定問題。本研究中277例標本中HPV 檢出率為79.06%，感染型別以低危型6/11型為主要型別，與陳冬蓮[8]及肖子娥和黃捷[9]的報告一致。感染以低危型別單一感染為主，多重感染則主要見于二重感染，維漢以及男女患者之間HPV 陽性檢出率差異均無統(tǒng)計學意義，說明民族和性別的差異并不會影響其檢出率。HPV 檢測結果各年齡段之間的陽性率以20～29歲組陽性率最高，其次為30～39歲、40～49歲年齡段，可能與性行為習慣及免疫系統(tǒng)等因素有關。用刮取分泌物、疣體涂擦法和微創(chuàng)取疣體新鮮組織法進行取樣，微創(chuàng)法與刮取法和涂擦法相比，微創(chuàng)法對HPV 檢出率最高，差異有統(tǒng)計學意義，與李榮敏等[10]結果一致，說明微創(chuàng)法可作為診斷尖銳濕疣的首選方法。但毛雨等[11]對尖銳濕疣患者用棉拭子摩擦疣體表面進行HP CR 分型檢測，結果表明其與微創(chuàng)法相比差異無統(tǒng)計學意義，并具有高敏感性，同時無明顯創(chuàng)傷性，可代替既往的切除或鉗取疣體。研究結果不同可能原因是無論直接取疣體組織，還是疣體表面脫落細胞，均有部分患者出現(xiàn)假陰性反應，一方面可能是未能提取到足夠的HP NA 模板，另一方面可能是該實驗檢測的23型以外HPV 感染所致以及存在個體差異因素。在今后的研究中，應進一步加大樣本量，對尖銳濕疣同一患者采用不同的取材方法將HPV 陽性率進行比較研究，這對于不同的患者人群，針對自身情況選擇最優(yōu)的取材方法，可更大程度的提高診斷的準確性具有一定的臨床意義。