桑枝低聚糖促乳酸菌生長(zhǎng)活性優(yōu)化研究

楊詩(shī)沅,鄒宇曉,胡騰根,李 倩,黎爾納,*,廖森泰,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 廣東 廣州 510642； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510610)

桑枝是桑的細(xì)長(zhǎng)枝條，是蠶桑資源中生物量占有比例最高的物質(zhì)。多糖是桑枝的主要活性物質(zhì)，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸等組成[1-2]。桑枝多糖主要由1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp組成骨架以及1,2-α-L-Araf、1,3,6-β-D-Galp、1,4-β-D-Xylp殘基組成分支[3]。

肥胖、糖尿病和心血管疾病等與人體腸道菌群失衡有關(guān)[4]，補(bǔ)充益生菌是預(yù)防和治療這些疾病的有效措施，補(bǔ)充含有益生菌的食品及益生菌制品是外源補(bǔ)充益生菌的主要方法[5]。低聚糖比多糖具有更高的益生活性，低聚糖類益生元的研究開發(fā)是益生菌活菌補(bǔ)充劑等微生態(tài)保健品的發(fā)展方向。張梅紅[6]采用戊聚糖酶及鹽酸制備不同分子量阿拉伯木聚糖，發(fā)現(xiàn)所制備的阿拉伯木聚糖均能促進(jìn)雙歧桿菌增殖，表現(xiàn)為降解程度越高，益生活性越好。Wang等[7]通過(guò)體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，菜籽多糖及其酶解片段能顯著促進(jìn)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌等益生菌的增殖，但菜籽多糖酶解片段的增殖效果更好。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于桑枝多糖的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)測(cè)定及降血糖、抗腫瘤、抗氧化等活性方面，桑枝多糖在食品領(lǐng)域的研究主要是桑枝多糖粉在醫(yī)療保健品及食品飲料上的利用，而對(duì)桑枝低聚糖類微生態(tài)食品的研究甚少。本研究采用物理超聲、化學(xué)酸解和生物酶解法制備桑枝低聚糖，考察桑枝低聚糖對(duì)乳酸菌增殖的效果，并對(duì)酶法制備的低聚糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，希望為桑枝低聚糖益生元在功能性食品中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑枝多糖(桑枝提取1-脫氧野尻霉素后醇沉獲得的粗多糖，經(jīng)檢測(cè)后其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為75%)，北京五和博澳藥業(yè)有限公司提供；MRS肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；β-甘露聚糖酶(50 U/mg)，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；硫酸、氫氧化鈉(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumGIM1.191)、腸膜明串珠菌(LeuconostocmesenteroidesGIM1.774)、干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiGIM1.411)、鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGIM1.325)，購(gòu)于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 主要儀器設(shè)備

THZ- D型臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHP- 9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW- CJ- 2FD型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌菌液的制備

取-80 ℃保存的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.2活菌總數(shù)及增殖率的測(cè)定

乳酸菌活菌總數(shù)的測(cè)定：菌落計(jì)數(shù)法，參考GB 4789.35—2016中乳酸菌菌落總數(shù)測(cè)定方法。將空白對(duì)照組(陰性)活菌總數(shù)設(shè)置為100%，乳酸菌增殖率計(jì)算方法見式(1)。

(1)

1.3.3不同水解方式對(duì)桑枝低聚糖促乳酸菌生長(zhǎng)的測(cè)定

1.3.3.1 桑枝低聚糖的制備

1)物理超聲水解制備桑枝低聚糖。根據(jù)Yu等[8]超聲降解紫菜多糖的方法，并稍做修改。將多糖溶液在25 ℃、500 W下超聲處理20 min，滅酶后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2)化學(xué)酸水解制備桑枝低聚糖。根據(jù)和法濤等[9]的猴頭菇酸水解工藝，并適當(dāng)調(diào)整。將多糖溶液按體積比為1∶1加入3 mol/L硫酸溶液，混合后于80 ℃下水浴酸水解3 h，水解結(jié)束后加入6 mol/L氫氧化鈉溶液中和，滅酶后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3)生物酶解制備桑枝低聚糖。根據(jù)繆月秋等[10]對(duì)葫蘆巴中性雜多糖酶解工藝，添加50 mg·mL-1的β-甘露聚糖酶于多糖溶液中，50 ℃酶解4 h，滅酶后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 3種方式制備的桑枝低聚糖促乳酸菌生長(zhǎng)的測(cè)定

分別添加經(jīng)3種方式制備的桑枝低聚糖、桑枝多糖和對(duì)照組商品化益生元(低聚異麥芽糖、低聚半乳糖)到MRS液體培養(yǎng)基，使質(zhì)量濃度達(dá)到3.00 mg·mL-1。向培養(yǎng)基中接種1%過(guò)夜培養(yǎng)的乳酸菌菌液，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1.3.2中方法計(jì)算乳酸菌增殖率。

1.3.4桑枝低聚糖濃度促鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的測(cè)定

將經(jīng)生物酶解法制備的桑枝低聚糖，添加到MRS液體培養(yǎng)基中，使終質(zhì)量濃度分別達(dá)到24.00、12.00、6.00、3.00、1.50、0.75 mg·mL-1。向培養(yǎng)基中接種1%過(guò)夜培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌菌液，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1.3.2中方法計(jì)算增殖率。

1.3.5桑枝低聚糖酶法制備條件的優(yōu)化

以鼠李糖乳桿菌增殖率為指標(biāo)，選擇不同β-甘露聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間，研究其對(duì)桑枝低聚糖酶解條件的影響。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表1。

表1 酶解條件及參數(shù)

1.3.6響應(yīng)面法對(duì)桑枝低聚糖生物酶解條件的優(yōu)化

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)酶解條件在三因素三水平上進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。采用SPSS和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同水解方式對(duì)桑枝低聚糖促乳酸菌生長(zhǎng)的影響

不同水解方式制備的低聚糖對(duì)4株乳酸菌增殖活性影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，經(jīng)生物酶解處理的低聚糖對(duì)4株乳酸菌的促生長(zhǎng)作用明顯，與桑枝多糖及商品化益生元(低聚異麥芽糖、低聚半乳糖)比較，均存在顯著性差異(P<0.05)，并且對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖率最高(311.42%±0.13%)。本研究表明，生物酶解處理的低聚糖對(duì)4株乳酸菌都具有良好的增殖作用。

表3 不同水解方式制備的桑枝低聚糖對(duì)4株乳酸菌增殖率的影響

數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”；根據(jù)Duncan的多范圍檢驗(yàn)，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 桑枝低聚糖濃度對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響

圖1 桑枝低聚糖濃度對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響Fig.1 Effect of different concentration of Ramulus mori oligosaccharide on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus

低聚糖濃度對(duì)鼠李糖乳桿菌益生活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，低聚糖質(zhì)量終濃度在0.75～6.00 mg·mL-1時(shí)，鼠李糖乳桿菌增殖率隨其質(zhì)量濃度增大而提高，并且在低聚糖質(zhì)量濃度為6.00 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大(356.67%±0.35%)，但質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大時(shí)，增殖率反而降低。這種情況可能是桑枝低聚糖濃度過(guò)高，溶液滲透壓增大，乳酸菌細(xì)胞脫水，且糖液黏度大，不利于菌落生長(zhǎng)繁殖。蔣艾廷等[11]通過(guò)增加培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的生長(zhǎng)呈先增大后減小的趨勢(shì)，推測(cè)可能是由于碳源濃度過(guò)高導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓過(guò)高，不利于酵母生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明作為乳酸菌體外增殖的益生元需要適宜的濃度。

2.3 酶法制備桑枝低聚糖條件的優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1酶法制備的桑枝低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率影響

圖2 酶解條件對(duì)酶法制備的桑枝低聚糖促鼠李糖乳桿菌增殖率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus promoted by enzymatic preparation of Ramulus mori oligosaccharides

酶法制備的桑枝低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率影響見圖2。β-甘露聚糖酶添加量在10.00～90.00 mg·mL-1時(shí)制備的低聚糖，對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖率呈先增后減的趨勢(shì)(圖2(a))。當(dāng)酶添加量為50.00 mg·mL-1時(shí)，增殖率達(dá)到最高值(369.33%±0.08%)；當(dāng)酶添加量大于50.00 mg·mL-1時(shí)，增殖率反而降低。這種情況可能是因?yàn)槎嗵堑幕钚耘c其分子質(zhì)量存在相互作用，只有一定分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多糖才具有較高活性[12]，過(guò)多的酶使多糖在短時(shí)間內(nèi)水解更徹底，被打斷成更小的片段，過(guò)度降解制備的低聚糖益生活性較低。

酶的活性與溫度有關(guān)，且存在最適反應(yīng)溫度。大部分β-甘露聚糖酶最適溫度在40～65 ℃，低于或高于最適溫度，酶不穩(wěn)定，活性降低甚至喪失[13-14]。不同酶解溫度制備桑枝低聚糖，對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響結(jié)果見圖2(b)。β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃時(shí)，桑枝低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖效果最好，此時(shí)增殖率為383.33%±0.23%。

不同酶解時(shí)間制備的桑枝低聚糖，對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(c)。酶解時(shí)間為2～6 h，增殖率呈先快速增加后緩慢降低趨勢(shì)，并在4 h時(shí)達(dá)到最高值367.00%±0.11%。這一現(xiàn)象可能是，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖降解量增加，糖鏈斷裂，產(chǎn)生更多的活性低聚糖；經(jīng)過(guò)4 h酶解形成的低聚糖更利于鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)，但水解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)使水解產(chǎn)物的組成發(fā)生改變，益生活性降低。從益生活性和成本考慮，認(rèn)為4 h的酶解時(shí)間較好。因此選擇β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定β-甘露聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見表4，二元多次回歸方程見式(2)。

增殖率=367.60-8.62×A-34.13×
B+15.75×C-24.50×A×B-56.25×
A×C+22.75×B×C-100.05×A2-
41.55×B2-69.80×C2。

(2)

響應(yīng)面模型的P值<0.000 1，說(shuō)明模型高度顯著，可信度高；模型的R2=0.991 4，校正R2=0.980 4，說(shuō)明該模型可以很好地模擬和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果；變異系數(shù)為4.27%，置信度較高，說(shuō)明模型可以反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值[15-16]，因此可以選擇該模型來(lái)分析桑枝多糖促益生活性的變化。

各因素交互作用對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響響應(yīng)曲面分析結(jié)果見圖3。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的酶解條件理論值為：酶添加量49.80 mg·mL-1、酶解溫度46.07 ℃、酶解時(shí)間 4.05 h，增殖率預(yù)測(cè)值為374.76%；為簡(jiǎn)化工藝，將條件調(diào)整為酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間4 h，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到實(shí)際增殖率為396.30%±0.42%，與預(yù)測(cè)值相符。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖3 各因素交互作用對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響Fig.3 Effects of interactive factors on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus

3 結(jié) 論

本研究采用物理超聲、化學(xué)酸解和生物酶法制備桑枝低聚糖，探討了低聚糖對(duì)植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌增殖率的影響；發(fā)現(xiàn)酶法制備的低聚糖能特異性地增殖鼠李糖乳桿菌。在各單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Bohnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，以鼠李糖乳桿菌增殖率為指標(biāo)，對(duì)低聚糖的酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酶法制備低聚糖的優(yōu)化工藝：β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間4 h，此時(shí)鼠李糖乳桿菌的增殖率為396.30%±0.42%，是桑枝多糖增殖率(144.98%±0.12%)的2.7倍，并且增殖效果優(yōu)于商品化益生元低聚異麥芽糖(158.13%±0.10%)和低聚半乳糖(186.16%±0.12%)。本研究?jī)?yōu)化了桑枝低聚糖的制備工藝，如果將其作為益生元添加于乳酸菌飲料或乳酸菌高密度培養(yǎng)體系中，對(duì)提高發(fā)酵效率、節(jié)約時(shí)間成本，將帶來(lái)較好的效果。