陳海軍 薄璐 郭鑫 張堃 赫麗杰 李強(qiáng) 李雨澤

我國是結(jié)核病大國，同時(shí)也是糖尿病大國，2017年我國結(jié)核病新發(fā)患者約為88.9萬例，糖尿病患者約為1.14億例[1-2]。研究顯示，糖尿病患者是并發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核的高危人群，且二者結(jié)合后疾病預(yù)后差，復(fù)發(fā)率、死亡率均明顯上升[3-5]，加大了臨床中2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)治療和控制的難度。目前關(guān)于T2DMTB的病因研究成為了熱點(diǎn)，其中從遺傳學(xué)角度探討炎癥因子基因多態(tài)性與T2DMTB的關(guān)系為學(xué)者們?cè)赥2DMTB的病因?qū)W研究中打開了思路。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水準(zhǔn)上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，SNP會(huì)影響個(gè)體對(duì)一些疾病易感性發(fā)生改變。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮抗感染作用[6]。Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)是TLR中的重要成員，研究顯示TLR2在抗結(jié)核中至關(guān)重要[7]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種屬于磷酸肌醇3-激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究表明mTOR有抗菌、免疫抑制和抗癌等特性，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖凋亡等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[8-10]。本研究對(duì)黑龍江省部分T2DMTB患者與單純2型糖尿病患者TLR2的rs3804100、rs3804099位點(diǎn)及mTOR的rs2295080位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討這3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核的關(guān)系。

材料和方法

一、研究對(duì)象

觀察組患者男199例，女101例；年齡20～87歲，平均(51.97±11.87)歲。對(duì)照組患者男171例，女129例；年齡20～87歲，平均(58.73±11.46)歲。

二、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組符合2型糖尿病的診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)[13]；觀察組除符合2型糖尿病的診斷，同時(shí)符合肺結(jié)核的診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)[14]。排除標(biāo)準(zhǔn)：非黑龍江省人群，非漢族人群，艾滋病、病毒性肝炎(乙、丙型)、梅毒患者，并發(fā)各種腫瘤、結(jié)締組織疾病、其他內(nèi)分泌疾病患者。

三、質(zhì)量控制

1. 調(diào)查員培訓(xùn)：所有參與書寫病例的醫(yī)師均經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)，明確錄入受試者信息的目的和意義，充分掌握錄入信息內(nèi)容的標(biāo)準(zhǔn)及注意事項(xiàng)。本研究統(tǒng)一規(guī)定了基本信息錄入表的填寫方法、相關(guān)定義說明、樣本的采集及保存方法。

2. 錄入信息的核實(shí)：所有參與書寫病例的醫(yī)師均經(jīng)過主治醫(yī)師及以上級(jí)別醫(yī)師培訓(xùn)，通過查找患者找到研究所需要的受試者信息，在查找取得的患者信息不完整時(shí)，應(yīng)與受試人群當(dāng)面進(jìn)行信息核實(shí)。

四、研究方法

(一)收集血清及資料

采集患者外周血2 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，低溫靜置，在4 ℃下以4500×g離心15 min后分離出上清液即血清樣本，存放于-80 ℃冰箱。收集T2DMTB、2型糖尿病患者基本資料，包括患者姓名、病歷號(hào)、性別、年齡、身高、體質(zhì)量等。

(二)實(shí)驗(yàn)過程

1. 血液DNA提?。翰捎帽本┨旄萍加邢薰旧a(chǎn)的血液(細(xì)胞或組織)基因組DNA提取試劑盒提取血液DNA，按照說明書步驟進(jìn)行操作。

2. PCR擴(kuò)增：使用定性PCR擴(kuò)增儀(7500 Fast型，美國Life公司)、Taqman探針法及Roche LightCycler480檢測(cè)系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)對(duì)基因進(jìn)行分型。在每96孔板中隨機(jī)選擇1～2個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)SNP信號(hào)都在滿足形成3個(gè)明顯分型點(diǎn)聚集簇的情況下，由LightCycler480的Endpoint Genotyping 軟件完成基因型分析。對(duì)于每個(gè)SNP位點(diǎn)，隨機(jī)選擇5%的樣本重復(fù)檢測(cè)[13]。探針信息：rs3804100，購于美國ThermoFisher公司，貨號(hào)為4351379， ID為C_ _25607727_10；rs3804099，購于美國ThermoFisher公司，貨號(hào)為4351379，ID為C_ _22274563_10；rs2296080，購于美國ThermoFisher公司，貨號(hào)為4351379，ID為C_ _16189146_10。熒光定量PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)基因TLR2、mTOR的rs3804100、rs3804099、rs2295080位點(diǎn)在T2DMTB與2型糖尿病人群之間的分布差異進(jìn)行比較，并進(jìn)一步采用logistic回歸分析3種基因位點(diǎn)在兩組患者間的分布差異，采用后退法，帶入回歸模型的分類變量賦值，見表2。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 logistic回歸模型中分類變量賦值情況

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤

結(jié) 果

1. 3種位點(diǎn)等位基因在觀察組和對(duì)照組之間的分布：TLR2的2個(gè)基因位點(diǎn)rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位點(diǎn)的等位基因在觀察組和對(duì)照組中分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表3。

2. 各因素與T2DMTB發(fā)病關(guān)系的單因素分析：兩組患者性別、年齡在觀察組和對(duì)照組中分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，TLR2的2個(gè)基因位點(diǎn)rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位點(diǎn)在觀察組和對(duì)照組中分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表4。

表3 觀察組和對(duì)照組中等位基因的對(duì)比分析

注a：胞嘧啶；b：鳥嘌呤；等位基因頻率=等位基因頻數(shù)/600×100%

表4 各因素與T2DMTB發(fā)病關(guān)系的單因素分析

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；年齡分組考慮到本研究收集的患者主要集中在≥50歲人群，<50歲人群例數(shù)較少，且疾病變化較≥50歲人群慢，故合并為一組，而≥50歲人群按每10歲為年齡段進(jìn)行分組

3. T2DMTB發(fā)病的logistic多因素分析：因單因素分析后顯示年齡、性別在兩組患者間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以將年齡和性別帶入logistic回歸模型中與分析變量一起進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示，TLR2及mTOR各基因位點(diǎn)多態(tài)性與T2DMTB之間均無相關(guān)性(P值均>0.05)。見表5。

表5 各因素與T2DMTB發(fā)病關(guān)系的logistic多因素分析

討 論

糖尿病與肺結(jié)核相互影響，相互促進(jìn)。糖尿病患者一般因?yàn)闄C(jī)體代謝紊亂而不能滿足對(duì)營養(yǎng)的基本需求，因此免疫功能低下，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌的概率增加。有研究顯示，2型糖尿病患者感染肺結(jié)核的概率是普通人感染肺結(jié)核的4～8倍[15]。同時(shí)，結(jié)核病又會(huì)加重糖尿病病情，消耗機(jī)體大量能量，加重糖尿病患者血糖的波動(dòng)[16]。Toll樣受體和mTOR是免疫防御體系中重要的炎癥因子，它們SNP位點(diǎn)的改變會(huì)影響正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄水平，甚至影響蛋白質(zhì)功能和免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體對(duì)某些感染的易感性增加。一些研究表明，TLR及mTOR均與機(jī)體抗結(jié)核免疫水平密切相關(guān)[12, 17]，且通過閱讀大量文獻(xiàn)可以得知TLR2的rs3804100、rs3804099位點(diǎn)及mTOR的rs2295080位點(diǎn)與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥密切相關(guān)[18-20]。在大量的文獻(xiàn)報(bào)道中[12,17-20]，不乏關(guān)于基因位點(diǎn)與單純結(jié)核病、單純糖尿病、糖尿病并發(fā)其他并發(fā)癥(非結(jié)核性)分別相關(guān)的研究，但關(guān)于基因位點(diǎn)與已經(jīng)發(fā)生糖尿病的患者易感結(jié)核病的研究分析并不多見，所以本研究對(duì)黑龍江省部分T2DMTB患者與單純2型糖尿病患者中TLR2的rs3804100、rs3804099位點(diǎn)及mTOR的rs2295080位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討這3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與T2DMTB的關(guān)系。

logistic分析結(jié)果顯示，TLR2的rs3804100、rs3804099位點(diǎn)及mTOR的rs2295080位點(diǎn)的基因多態(tài)性均與T2DMTB無關(guān)。分析原因首先可能是因?yàn)闃颖玖窟€不夠大；且由于研究群體為黑龍江省人群，不能代表其他地區(qū)人群也有相同結(jié)論；如之前有研究顯示，在河北省石家莊人群中rs3804099的CC基因型與結(jié)核易感性有關(guān)[21]，但本研究中并未得出此結(jié)論，可能跟地區(qū)、人群差異有關(guān)。另外，本研究中沒有納入健康人群作為對(duì)比，由于兩組均為2型糖尿病患者，有可能在兩組患者中都存在3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性。并且也沒有通過ELISA試劑盒檢測(cè)TLR2、mTOR在患者血清中的水平；研究中只檢測(cè)了3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性，TLR2、mTOR均與肺結(jié)核相關(guān)，途徑中可能存在其他位點(diǎn)及單倍型[22]；其次本研究?jī)H通過校正控制了年齡、性別在兩組中的均衡性，并沒有對(duì)其他可能影響基因多態(tài)性與疾病關(guān)系的因素進(jìn)行控制，也可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生偏倚。

在今后的相關(guān)研究中，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，并納入一部分匹配的健康人作為對(duì)照；并對(duì)影響因素如體質(zhì)量指數(shù)，是否吸煙、飲酒，空腹血糖情況，是否口服降糖藥，是否使用胰島素等在組間的均衡性進(jìn)行嚴(yán)格控制。同時(shí)對(duì)TLR2及mTOR的其他位點(diǎn)進(jìn)行分析，并對(duì)患者進(jìn)行相關(guān)血清分子學(xué)檢測(cè)，從分子水平、基因水平及其他水平共同分析探討，豐富完善對(duì)TLR2及mTOR基因多態(tài)性與T2DMTB關(guān)系的研究。