丁丹丹，程如玉，韓 瑞，張 姍，丁 翔，王尚華，王倩倩，韓影影，徐錦程

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是口腔癌中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，男、女性均可發(fā)病，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，并且發(fā)病年齡年輕化[1]。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一，因此探討TSCC的EMT發(fā)生機(jī)制，對(duì)于改善預(yù)后，提高患者的生存率至關(guān)重要。Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)中凋亡抑制作用最強(qiáng)的蛋白，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。目前，Survivin與TSCC組織EMT表型的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文檢測(cè)Survivin和EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin在TSCC中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，以期為TSCC的相關(guān)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科2015年1月～2018年12月手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的TSCC蠟塊標(biāo)本63例。所有患者均行手術(shù)切除，術(shù)前未接受放、化療等?；颊吣挲g29～81歲，中位年齡55歲，男性45例，女性18例。腫瘤直徑<2.0 cm者27例，2.0～4.0 cm者23例，>4.0 cm者13例。依據(jù)AJCC(2010年)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)臨床分期進(jìn)行劃分，Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期 26例。根據(jù)WHO(1997)口腔鱗狀細(xì)胞癌的分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病理分級(jí)進(jìn)行劃分，Ⅰ級(jí)22例，Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)20例。發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，其中有18例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目為1～3枚，6例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目>3枚；未發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。選取8例符合要求的新鮮TSCC組織標(biāo)本，取材收集后，即刻轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。另選擇63例相應(yīng)癌旁正常上皮組織作為對(duì)照組。

1.2 試劑兔抗人Survivin、E-cadherin、N-cadherin抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；即用型免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色劑及兔抗人β-actin抗體，均購(gòu)自福州邁新公司；稀釋液及SDS-PAGE電泳試劑盒，均購(gòu)自北京碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。

1.3 免疫組化TSCC組織蠟塊標(biāo)本均制成4 μm厚的切片，免疫組化染色采用EnVision法。一抗用PBS緩沖液代替作為陰性對(duì)照，而已知的TSCC組織切片則作為陽(yáng)性對(duì)照。一抗Survivin、E-cadherin及N-cadherin稀釋比均為1 ∶300。

1.4 結(jié)果判定Survivin主要表達(dá)于細(xì)胞核，E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，N-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每例隨機(jī)選擇10個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≥3分為陽(yáng)性，<3 分為陰性。

1.5 Western blot法常規(guī)提取組織中蛋白，采用SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫浸泡于5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入一抗Survivin、E-cadherin、N-cadherin以1 ∶500的比例稀釋，β-actin以1 ∶1 000比例稀釋，4 ℃過(guò)夜。次日，TBST洗滌2～3次后孵育二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 1 ∶2 000)2 h，TBST洗滌2～3次。暗室中將混勻的發(fā)光液均勻涂在PVDF膜上，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并通過(guò)圖像分析軟件測(cè)定各條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析Survivin與TSCC臨床病理特征的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)Survivin表達(dá)與EMT標(biāo)志蛋白的免疫組化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，采用t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、E-cadherin及N-cadherin在TSCC和癌旁正常上皮組織中的表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，TSCC組織中Survivin陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞核，E-cadherin陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞膜，N-cadherin陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)(圖1～7)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，三者在TSCC和癌旁正常組織中的陽(yáng)性率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 Survivin、E-cadherin及N-cadherin與TSCC臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，臨床分期及病理分級(jí)越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TSCC組織中Survivin陽(yáng)性率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其表達(dá)與腫瘤直徑、性別、年齡均無(wú)關(guān)(P>0.05)。E-cadherin和N-cadherin表達(dá)與TSCC臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與腫瘤直徑、患者性別及年齡均無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)與免疫組化結(jié)果一致(圖8)。

圖1 Survivin在癌旁正常上皮組織中的表達(dá),EnVision法圖2 Survivin在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TSCC組織中的表達(dá),EnVision法 圖3 Survivin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TSCC組織中的表達(dá),En-Vision法 圖4 E-cadhrin在癌旁正常上皮組織中的表達(dá),EnVision法 圖5 E-cadher-in在TSCC組織中的表達(dá),EnVi-sion法 圖6 N-cadherin在癌旁正常上皮組織中的表達(dá)，EnVision法 圖7 N-caderin在TSCC組織中的表達(dá)，EnVision法

表1 TSCC和癌旁正常組織中Survivin、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)[n(%)]

表2 TSCC中Survivin、E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖8 Survivin、N-cadherin、E-cadherin在TSCC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.3 TSCC組織中Survivin與E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性TSCC組織中E-cadherin和N-cadherin的陽(yáng)性率分別為42.9%和69.8%。相關(guān)性分析顯示，Survivin與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.315，P=0.012)，與N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.474，P<0.001，表3)。

3 討論

有研究表明，EMT是癌細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的首要環(huán)節(jié)[3]。EMT是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附而獲得間質(zhì)特征的可逆過(guò)程，其中E-cadherin和N-cadherin是EMT的主要特征性蛋白。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，表現(xiàn)為上皮性標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)，如E-cadherin；而間質(zhì)型標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，如N-cadherin[4]。因此，可通過(guò)檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin來(lái)鑒定EMT的發(fā)生。本組結(jié)果顯示，E-cadherin在TSCC組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，且隨著腫瘤臨床分期、病理分級(jí)越高，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目越多，E-cadherin在TSCC組織中的表達(dá)越低。N-cadherin在TSCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且隨著腫瘤臨床分期、病理分級(jí)越高，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，N-cadherin在TSCC組織中的表達(dá)越高。

表3 TSCC中Survivin與E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

Survivin在多數(shù)腫瘤中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Survivin作為節(jié)點(diǎn)蛋白，與參與有絲分裂、凋亡、功能整合增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的多種信號(hào)相互作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7-10]，Survivin與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNM分期越高則Survivin表達(dá)越高，病理分級(jí)越高則Survivin表達(dá)越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Survivin表達(dá)越高，提示Survivin表達(dá)增強(qiáng)可能對(duì)TSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要的促進(jìn)作用。

有研究表明[11-13]，Survivin對(duì)EMT有潛在的誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)結(jié)腸癌及卵巢癌的轉(zhuǎn)移。本組結(jié)果表明，在TSCC組織中Survivin的表達(dá)與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin呈正相關(guān)，提示Survivin可能作為誘導(dǎo)EMT進(jìn)程的誘因之一，參與多種信號(hào)通路(TGFb、ERK1/2、P13K/AKT)促進(jìn)癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[14]。本組僅在組織水平驗(yàn)證Survivin與EMT在TSCC組織中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析，而Survivin是通過(guò)何種途徑調(diào)控TSCC組織EMT的發(fā)生需更深入的探討。