江地科，項(xiàng)明源，王 印*，姚學(xué)萍，楊澤曉，張鵬飛，廖倡宇，鄔旭龍*

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130; 2．動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 溫江 611130)

【研究意義】近年來，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；潭炔粩嗵岣?、畜產(chǎn)品流通異常頻繁的同時(shí)，病原感染情況也在持續(xù)增長(zhǎng)，表現(xiàn)為單一病原感染或者多種疾病混合感染以及新變異株的頻繁出現(xiàn)。如豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneuromoniae，APP)、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)、豬多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, Pm)等疾病都是造成豬群呼吸道疾病的主要病原[1]。同時(shí)，CSFV、PRRSV、PRV、PCV2也是引起豬繁殖障礙疾病的病原之一[2]。豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)的感染造成豬群嘔吐、腹瀉、脫水，具有較高的致死率[3-4]。目前關(guān)于四川省養(yǎng)豬業(yè)的疾病流行情況調(diào)查，現(xiàn)有研究主要針對(duì)單一系統(tǒng)性病原調(diào)查，【前人研究進(jìn)展】如：豬群呼吸系統(tǒng)疾病病原調(diào)查與分析、豬群繁殖系統(tǒng)疾病病原調(diào)查與分析、豬群腹瀉病原調(diào)查與分析，但未見對(duì)豬群各系統(tǒng)主要流行疾病做出全面的調(diào)查與分析[5-7]。【本研究切入點(diǎn)】本研究擬采用細(xì)菌分離鑒定、RT-PCR和PCR，對(duì)四川省2016年1月至2017年12月12個(gè)地區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)送檢病料進(jìn)行相關(guān)病原學(xué)檢測(cè)，調(diào)查各病原陽(yáng)性率，分析疾病發(fā)生的季節(jié)規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為四川地區(qū)豬群相關(guān)病原的防控提供有效參考依據(jù)，降低疫病給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料樣本分別來自2016年1月至2017年12月期間，四川省成都、遂寧、西昌、樂山、綿陽(yáng)、南充、德陽(yáng)等12個(gè)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)共283份發(fā)病病料，其中病死豬病變組織106份(肺、腎、肝、脾、心等)、公豬精液68份、流產(chǎn)胎和死胎63份、腹瀉豬腸黏膜和糞便46份。CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、Pm、SS2、 APP、PEDV和PoRV陽(yáng)性樣品為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、TSA培養(yǎng)基、蛋白酶K、Tris飽和酚購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；小牛血清購(gòu)自GIBCO公司；異丙醇、三氯甲烷等均由四川西隴化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 引物

分別參照GenBank中登錄的各病原參考株保守基因序列并參考文獻(xiàn)[8-11]進(jìn)行引物設(shè)計(jì)與合成，引物送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定

取病變肺組織劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃分別進(jìn)行需氧與厭氧培養(yǎng)，24～48 h后觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢并純化，提取細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃保存。

1.5 病料DNA/RNA核酸提取

采用蛋白酶K/Trizol方法提取病料樣品總DNA/RNA，-20 ℃保存[12]。

1.6 PCR/RT-PCR擴(kuò)增

以1.5提取的病料樣品基因組DNA為模板(提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA)，進(jìn)行相應(yīng)樣品病原的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，上、下游引物序列各1.5 μl，模板2 μl，加ddH2O補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；退火(表1)30 s；延伸72 ℃ 1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4℃保存。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 將細(xì)菌DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示分別出現(xiàn)了約為364、495、464 bp的片段，與陽(yáng)性對(duì)照相符，陰性對(duì)照無特異性片段出現(xiàn)(圖1)。結(jié)果顯示，分離菌株分別為APP、SS2、Pm。

2.1.2 病毒基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 將病料樣品RNA/DNA，進(jìn)行RT-PCR/PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶分別約為192、400、868、1154、553、774、297 bp，與陽(yáng)性對(duì)照相符，陰性對(duì)照均無特異性片段出現(xiàn)(圖2)。結(jié)果顯示，CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、PEDV、PoRV為陽(yáng)性。

表1 引物序列Table 1 The sequences of Prime

M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP,SS2,Pm陽(yáng)性對(duì)照; 2,5,8.陰性對(duì)照;3,6,9.樣品M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP, SS2, Pm Positive control; 2,5,8.Negative control;3,6,9.Samples圖1 APP,SS2,Pm基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of APP, SS2, Pm gene

2.2 病死豬病變組織病原檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 病死豬病變組織病原分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果 共檢測(cè)臨床病料106份(心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等)。結(jié)果顯示，病毒PCR檢測(cè)中 PCV2、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PRV陽(yáng)性率較高，分別為34.91 %(37/106)、40.57 %(43/106)、20.75 %(22/106)、16.04 %(17/106)(表2)。其中，PRRSV NADC30-Like變異株陽(yáng)性率20.75 %，是造成豬群死亡的重要原因之一。在細(xì)菌分離中，Pm陽(yáng)性率最高，為19.81 %(21/106)。

2.2.2 病死豬病變組織病料在不同季節(jié)病原檢測(cè)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)以上幾種病原在不同季節(jié)的陽(yáng)性率。結(jié)果顯示，PCV2無明顯的季節(jié)性，一年四季均可感染；PRV在冬季感染率較高，為28.57 %(10/35)；CSFV在各個(gè)季節(jié)的感染率均較低；PRRSV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別55 %(11/20)、45 %(18/40)、34.29 %(12/35)；PRRSV NADC30-Like在夏季和冬季感染率較高，分別為36.36 %(4/11)和28.57 %(10/35)；Pm在春季和冬季感染率較高為40 %(8/20)和28.57 %(10/35)；APP在夏季感染率較高為27.27 %；SS2在各個(gè)季節(jié)的感染率均較低(表3)。

2.2.3 病死豬病變組織病料感染結(jié)果 豬群發(fā)病與死亡的主要原因以病原混合感染為主，混合感染率為60.49 %(49/81)。結(jié)果顯示，多以二重感染類型為主，占61.22 %(30/49)。此外，PRRSV和PCV2混合其他病原感染最為常見，分別占混合感染樣品的44.90 %(22/49)和51.02 %(25/49) (表4)。

2.3 公豬精液病原檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 公豬精液病原分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果 共檢測(cè)精液68份。病毒PCR檢測(cè)中PCV2、PRRSV、PRV陽(yáng)性率較高，分別為20.59 %(14/68)、30.88 %(21/68)、20.59 %(14/68)。CSFV較低，為10.29 %(7/68)(表2)。

M.DL2000 DNA marker;1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,NADC30-Like,PCV2,PRV,PEDV,PoRV陽(yáng)性對(duì)照；2,5,8,11,14,17,20.陰性對(duì)照；3,6,9,12,15,18,21.樣品M， DL2000 DNA marker; 1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV Positive control; 2,5,8,11,14,17,20.Negative control;3,6,9,12,15,18,21.Samples圖2 CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV, PoRV 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV gene

表2 不同病原檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of etiological survey of different pathogens

2.3.2 公豬精液病料在不同季節(jié)病原檢測(cè)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)以上幾種病原在不同季節(jié)的陽(yáng)性率。結(jié)果顯示，CSFV在各個(gè)季節(jié)感染率均較低；PCV2在秋季和冬季感染率較高，分別為31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)；PRRSV在夏季感染率最高，達(dá)到70.59 %(12/17)； PRV在夏季、秋季、冬季感染率較高，分別為23.53 %(4/17)、31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)(表3)。

2.3.3 公豬精液病料感染結(jié)果 公豬精液帶毒主要是由單一病原感染為主，單一感染率為52.63 %(20/38)。PRRSV感染率最高，為45 %(9/20)(表4)。

2.4 流產(chǎn)胎、死胎病原檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 流產(chǎn)胎、死胎病原分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果 共檢測(cè)病料63份。結(jié)果顯示，病毒PCR檢測(cè)中 PCV2、PRRSV、PRV陽(yáng)性率較高，分別為38.10 %(24/63)、46.03 %(29/63)、30.16 %(19/63)。CSFV較低，為6.35 %(4/63)(表2)。

2.4.2 流產(chǎn)胎、死胎病料在不同季節(jié)病原檢測(cè)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)以上幾種疾病在不同季節(jié)的陽(yáng)性率。結(jié)果顯示，CSFV在一年四季基本平靜；PRRSV在一年四季均可感染，其中夏季感染率最高為70 %(7/10)；PCV2在夏季、秋季和冬季呈較高感染率，分別為70 %(7/10)、57.14 %(8/14)和38.89 %(7/18)；PRV無明顯的季節(jié)性，一年四季均可感染(表3)。

2.4.3 流產(chǎn)胎、死胎病原感染結(jié)果 仔豬流產(chǎn)和死亡的主要原因是由病原混合感染為主，混合感染率為74.50 %(38/51)。結(jié)果顯示，以二重和三重感染為主，分別占55.26 %(21/38)和31.58 %(12/38)。以PRRSV混合其他病感染最為常見，分別占混合感染樣品的44.74 %(17/38)(表4)。

表3 不同時(shí)間病原檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of etiological investigation of different pathogens of different seasons

表4 不同病原混合感染檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of mixed infection of different pathogens

2.5 腹瀉豬腸黏膜和糞便病原檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 腹瀉豬腸黏膜和糞便病原分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果 共檢測(cè)腹瀉病料46份。結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性率最高，為56.52 %(26/46)。PoRV陽(yáng)性率為26.09 %(12/46)。

2.5.2 腹瀉豬腸黏膜和糞便病料在不同季節(jié)病原檢測(cè)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)以上兩種病原在不同季節(jié)的陽(yáng)性率。PEDV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別為45.45 %(5/11)、28.57 %(2/7)和82.61 %(19/23)；PoRV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別為36.36 %(4/11)、28.57 %(2/7)和34.78 %(8/23)。據(jù)報(bào)道，PEDV具有季節(jié)流行性，大多數(shù)流行于冬季、春季，但從本次研究結(jié)果來看，PEDV除了在冬、春季節(jié)流行外，在秋季也多發(fā)。

3 討 論

病死豬病變組織病原調(diào)查結(jié)果顯示，PRRSV陽(yáng)性率最高，為40.57 %。有研究表明PRRSV可導(dǎo)致感染豬群免疫受到抑制、降低機(jī)體免疫力與抵抗力從而導(dǎo)致細(xì)菌侵入機(jī)體，引發(fā)繼發(fā)性感染，造成豬群大規(guī)模死亡[13]。楊漢春等人報(bào)道2016年，我國(guó)東北部部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒類-NADC30毒株陽(yáng)性率高達(dá)18 %，該毒株持續(xù)流行與傳播，疫情涉及地區(qū)包括北京、河北、山西、四川、廣東、河南、福建等地[14]。本研究調(diào)查結(jié)果顯示，PRRSV NADC30-like陽(yáng)性率為20 %，表明該毒株在四川地區(qū)已逐漸呈流行趨勢(shì)，此外，Zhou Lei等研究表明目前商業(yè)PRRSV疫苗不能為NADC30-like提供全面的保護(hù)，也是導(dǎo)致豬群死亡的重要原因之一[15]。細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示，Pm陽(yáng)性率最高：19.81 %，遠(yuǎn)高于官正對(duì)四川川東部分規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬呼吸道混合感染中Pm(0.55 %)的調(diào)查結(jié)果[16]。值得注意的是，在細(xì)菌分離鑒定過程中，通過PCR也檢測(cè)到APP、SS2和PRRSV、PCV2等病原混合感染，多以PCV2和Pm二重感染為主，推測(cè)其致病過程，可能是由PRRSV和PCV2等病毒性疾病引起豬群免疫受到抑制，使機(jī)體免疫降低，從而導(dǎo)致細(xì)菌侵入引起繼發(fā)性感染。

公豬精液與流產(chǎn)胎、死胎病原調(diào)查結(jié)果顯示，PRRSV陽(yáng)性率最高，陽(yáng)性率分別為：30.88 %、46.03 %。宋玉慧等對(duì)146份臨床疑似豬繁殖障礙性疾病的病料調(diào)查結(jié)果顯示，PRRSV陽(yáng)性率最高，為40.41 %[17]。吳永剛等對(duì)四川省部分地區(qū)公豬精液六種病毒性疾病的分子檢測(cè)，結(jié)果顯示PRRSV陽(yáng)性率為11.90 %[18]。本研究調(diào)查結(jié)果表明，引起規(guī)?；i場(chǎng)豬群繁殖障礙疾病主要是以二重感染為主，以PRRSV感染其他病原最為常見。其中，公豬感染繁殖障礙疾病病原后，通常情況下并不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但可作為病毒攜帶體，通過與母豬交配或人工受精將病原傳給母豬，病原經(jīng)胎盤屏障垂直傳播給胎兒，從而引發(fā)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊等繁殖障礙疾病，是引起目前規(guī)?；i場(chǎng)繁殖障礙性疾病高發(fā)病率與死亡率的原因[19-20]。

腹瀉豬腸黏膜和糞便病原調(diào)查結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性率最高為56.52 %，且主要呈單一感染，是引起豬群腹瀉死亡的主要病原。劉云波等、常鐵城、曹恭貌等對(duì)我國(guó)部分地區(qū)豬場(chǎng)腹瀉病毒感染狀況調(diào)查結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性率最高[21-23]。此外，Sun等研究證明母豬乳汁也能檢測(cè)到PEDV，所以PEDV可能通過母乳傳播[24]。本研究通過對(duì)四川地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)常見病原的流行病學(xué)調(diào)查，為相應(yīng)豬場(chǎng)在疾病防控、流行情況提供一定的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究主要通過規(guī)?；i場(chǎng)的“豬群呼吸系統(tǒng)疾病病原”、“豬群繁殖系統(tǒng)疾病病原”、“豬群腹瀉病原” 三大板塊進(jìn)行調(diào)查與分析，發(fā)現(xiàn)引起豬群呼吸道疾病和豬群繁殖系統(tǒng)疾病的主要病原還是PRRSV或者是PRRSV混合其他病原進(jìn)行混合感染，引起豬群腹瀉疾病的病原主要還是PEDV。但通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)PRRSV NADC30-like陽(yáng)性率為20 %，具有上升趨勢(shì)。本研究通過對(duì)四川地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)常見病源的流行病學(xué)調(diào)查，為相應(yīng)豬場(chǎng)在疾病防控、流行情況提供一定的科學(xué)依據(jù)。