紅棗汁乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究

余 偲，趙 育，張 晶，陳 悅，白莉圓，張寶善,2

(1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2.陜西省果蔬深加工工程技術(shù)研究中心，西安 710119)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)為一種天然的活性成分，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、治療癲癇、緩解失眠和焦慮、合成大腦蛋白質(zhì)[1]、調(diào)節(jié)血清中脂質(zhì)水平[2]、抑制癌細胞增殖等諸多生理功效[3]。GABA已被作為一種新型的功能成分應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域。目前生產(chǎn)GABA方法主要有化學(xué)合成和微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵法安全、成本低，是目前最有應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)化技術(shù)[4]。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是消耗碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然界中[5]，對人體有許多有益的生理功能。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后能夠改善食品的口感、營養(yǎng)成分，提高食品貯藏性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)能夠合成GABA的乳酸菌有短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、德氏乳桿菌(Lactobacillusgermanica)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等菌株[6]。

紅棗汁中營養(yǎng)成分和添加物等都會影響發(fā)酵液中GABA的含量[6]，本試驗利用植物乳桿菌和短乳桿菌混和發(fā)酵，研究紅棗汁乳酸發(fā)酵過程中谷氨酸鈉(sodium glutamate,MSG)、氮源、可溶性固形物含量、MgSO4、KH2PO4添加量對乳酸菌生產(chǎn)GABA的影響，以及發(fā)酵前后總酸、pH、氨基酸等指標(biāo)的變化，開發(fā)出富含GABA的紅棗汁乳酸發(fā)酵產(chǎn)品，為紅棗資源高效利用，同時也為開發(fā)富含GABA的功能性食品提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 發(fā)酵菌種 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP) CICC24202，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,LB)YM1301，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentans，LF)CGMCC1.1880，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，LG)LG-11，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，LM)CICC20714。

1.1.2 紅棗汁加工 選用干凈、無病蟲害、無霉變的新疆干制駿棗。清洗干凈，去核，按照紅棗與水的質(zhì)量比為1∶4加入純凈水，100 ℃預(yù)煮10 min，冷卻后用打漿機破碎，按質(zhì)量比加入 0.2%的果膠酶，在50 ℃下酶解3 h，用200目尼龍篩網(wǎng)過濾取汁，備用。

1.1.3 乳酸菌的擴大培養(yǎng) 將試驗用的乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基上進行涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過2次MRS液體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)擴培；將菌懸液轉(zhuǎn)移于5 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入0.85%的無菌生理鹽水清洗兩次，再用無菌生理鹽水懸浮，調(diào)整菌懸液濃度為1×108mL-1，備用[8]。

將試驗用的紅棗汁放入高壓滅菌鍋中，105 ℃下殺菌10 min，冷卻至室溫后，將乳酸菌轉(zhuǎn)接至紅棗汁中。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 發(fā)酵菌種的篩選 高產(chǎn)乳酸菌株的篩選：調(diào)整紅棗汁可溶性固形物含量為15%，殺菌后，分別接入菌懸液濃度為1×108mL-1的LP、LB、LF、LG、LM，接種量按體積分?jǐn)?shù)8%加入，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間60 h。

高產(chǎn)GABA菌株的篩選：在MRS液體培養(yǎng)基中加入5 g/L的MSG，其他條件同高產(chǎn)乳酸菌株的篩選。

1.2.2 不同發(fā)酵添加物對GABA產(chǎn)量的影響 MSG質(zhì)量濃度：用葡萄糖調(diào)整紅棗汁可溶性固形物含量為15%，分別添加0、2、4、5、6、8、10 g/L的MSG，殺菌后，接入菌懸液濃度為1×108mL-1的LP和LB，接種量按體積分?jǐn)?shù)4%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間60 h。

乳清粉質(zhì)量濃度：在紅棗汁中添加5 g/L的MSG，用牛奶乳清粉調(diào)節(jié)發(fā)酵液的氮源濃度，乳清粉的添加量分別為2、4、6、8、10、12 g/L，其他條件同MSG添加量單因素試驗。

可溶性固形物含量：在紅棗汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，用葡萄糖和純凈水調(diào)整可溶性固形物含量分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%。其他條件同MSG添加量單因素試驗。

MgSO4質(zhì)量濃度：在紅棗汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，調(diào)整可溶性固形物含量為20%，MgSO4作為硫酸根離子添加量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 g/L[9]，其他條件同MSG添加量單因素試驗。

KH2PO4質(zhì)量濃度：在紅棗汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，調(diào)整可溶性固形物含量為20%，0.4 g/L MgSO4，KH2PO4作為緩沖鹽添加量分別為2、11、20、30、40、50 g/L，其他條件同MSG添加量單因素試驗。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 通過“1.2.2”單因素試驗，選擇氮源(乳清粉)、可溶性固形物、 MgSO4、KH2PO4各因子進一步分析，設(shè)計4因素3水平Box-Behnken試驗，因素水平編碼見表1。

表1 中心組合設(shè)計試驗因素水平表Table 1 Level table for test factor of center combination design

1.3 測定項目及方法

在紅棗汁中添加5 g/L的MSG、11 g/L牛奶乳清粉、0.4 g/L MgSO4、15 g/L KH2PO4，用葡萄糖調(diào)整其可溶性固形物為20%，置于37 ℃條件下靜置發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中乳酸、pH、還原糖、總酚、GABA及氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.1 總酸、pH、還原糖及總酚 總酸采用酸堿滴定法(以乳酸計)[10]，pH用pH計直接測定。還原糖采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[11]，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，即為：y=0.628 7x- 0.001 9，R2=0.999 1。總酚采用福林酚法[12]。

1.3.2 GABA產(chǎn)量 采用HPLC法測定，參照黃俊[13]的方法并適當(dāng)改動。Diamonsil C18色譜柱，柱溫30 ℃，規(guī)格為250 mm×4.6 mm，紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為四氫呋喃、甲醇、0.05 mol/L醋酸鈉(pH 6.2)，比例為(5∶75∶420)，流速0.8 mL/min，梯度洗脫。

衍生試劑的配制：稱取鄰苯二甲醛(OPA) 10 mg加入10 μL的β-巰基乙醇，再加入2.5 mL乙腈進行溶解，混勻，避光保存[14]。

0.4 mol/L硼酸緩沖液的配制：稱取硼酸 24.7 g，加入1 L超純水進行溶解，調(diào)節(jié)pH為10.4。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，通過高效液相色譜法測得峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，即y= 0.080 3x-2.072 8，R2=0.999 2。

樣品測定：發(fā)酵后的紅棗汁在8 000 r/min條件下離心10 min，取樣液100 μL，加入0.4 mol/L的硼酸緩沖液1 mL和OPA衍生液200 μL，混勻后，衍生化反應(yīng)30 min進樣測定。利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度[15]。

1.3.3 氨基酸分析 將紅棗乳酸發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液加入 6 mol/L鹽酸，超聲2 min，氮氣吹掃2 min后封口；將消化管置于110 ℃烘箱22 h進行消化，過濾，取上清液用全自動氨基酸分析儀分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用Excel 2010對試驗結(jié)果進行處理分析，試驗重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

2.1.1 不同乳酸菌發(fā)酵過程中總酸和pH的變化 如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的增加，總酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)上升的趨勢，這是由于乳酸菌利用紅棗汁中的糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)生乳酸使酸度上升的結(jié)果[16]。當(dāng)發(fā)酵時間為60 h，LP發(fā)酵紅棗汁中乳酸質(zhì)量濃度最大，從最初5.81 g/L增加到15.8 g/L，其次是LG和LB菌株，發(fā)酵時間大于60 h后，發(fā)酵液中的總酸質(zhì)量濃度基本趨于 穩(wěn)定。

圖1 發(fā)酵過程中總酸質(zhì)量濃度Fig.1 Total acid mass concentration during fermentation

由圖2可知，pH隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為60 h時，不同菌種發(fā)酵后LP使紅棗汁pH變化最大，其次是LB和LG，這與總酸質(zhì)量濃度分析結(jié)果基本一致，也表明LP在紅棗汁中生長良好，能夠加速發(fā)酵進程縮短發(fā)酵周期，同時產(chǎn)酸量增加能夠降低物質(zhì)的pH，使發(fā)酵后產(chǎn)品貯藏性能提高[17]。為了獲得產(chǎn)酸量最高的菌株，選擇LP作為發(fā)酵菌種。

圖2 發(fā)酵過程中pHFig.2 pH during fermentation

2.1.2 不同菌種發(fā)酵對GABA產(chǎn)量的影響 由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵60 h時，5種菌株中LB將MSG轉(zhuǎn)化為GABA的能力最強，產(chǎn)生GABA質(zhì)量濃度最多，為1 705.46 μg/mL，其次為LP、LF和LM菌株。為使發(fā)酵后的紅棗汁飲品富含 GABA，選擇產(chǎn)生GABA量最高的LB菌株作為發(fā)酵菌種。

圖3 不同菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力Fig.3 Ability of different strains to produce GABA by fermentation

為了獲得富含高產(chǎn)酸和高GABA的益生菌紅棗汁飲品，通過上述的篩選結(jié)果，在接下來的試驗中利用LP和LB混合菌種發(fā)酵紅棗汁。

2.2 不同底物添加量對GABA產(chǎn)量的變化

由表2可知，不同底物添加量能夠影響發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度。MSG添加量在 2～5 g/L時，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)上升的趨勢，超過5 g/L時，GABA質(zhì)量濃度趨于平穩(wěn)。這可能由于發(fā)酵液中高酸度和低pH限制了菌株對MSG的轉(zhuǎn)化[15]，同時MSG添加量超過5 g/L時，會影響紅棗汁的口感。因此，選擇MSG添加量為5 g/L。

乳清粉添加量在2～10 g/L時，GABA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)添加量超過10 g/L，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度逐漸降低。這可能是由于發(fā)酵液中氮源添加量過大，導(dǎo)致微生物過度生長老化，對GABA質(zhì)量濃度產(chǎn)生了影響[18]。因此，選擇乳清粉添加量為10 g/L。

可溶性固形物含量在5%～20%時，GABA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)不斷增加，超過20%時，GABA逐漸下降，這可能是紅棗汁中糖含量過高，滲透壓變大，導(dǎo)致乳酸菌細胞脫水而活力下降使GABA積累量降低[19]，同時過高的可溶性固形物會使發(fā)酵液中糖含量過高導(dǎo)致口感降低。因此，選擇可溶性固形物含量為20%。

MgSO4添加量在0.2～0.4 g/L，隨著MgSO4質(zhì)量濃度的增加，GABA合成量也在不斷增加，說明MgSO4能夠提高GABA的產(chǎn)量[9]。當(dāng)添加量在0.4 g/L，MgSO4對菌體產(chǎn)GABA的促進作用最強；之后繼續(xù)增大MgSO4添加量時，GABA合成量不斷的降低，這是由于過高的硫酸根離子對菌體產(chǎn)GABA起到抑制作用。因此，選擇MgSO4添加量為0.4 g/L。

KH2PO4的添加能夠調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH使GABA產(chǎn)量增加。當(dāng)KH2PO4添加量為11 g/L時，GABA產(chǎn)量最大；當(dāng)添加量超過11 g/L時，GABA質(zhì)量濃度出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是過高的 KH2PO4質(zhì)量濃度使得發(fā)酵液中K+濃度過高，對細胞滲透壓造成了影響，使乳酸菌活力降低[20]。因此，選擇KH2PO4添加量為11 g/L。

表2 不同底物乳酸菌發(fā)酵紅棗汁中GABA質(zhì)量濃度Table 2 GABA mass concentration in red jujube juice fermented by lactic acid bacteria under different substractes

2.3 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

以牛奶乳清粉、可溶性固形物含量、MgSO4及 KH2PO4添加量為4個因素，GABA質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表3。

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析得出乳酸菌發(fā)酵紅棗汁產(chǎn)GABA最佳工藝條件為：牛奶乳清粉添加量11 g/L，可溶性固形物含量21.81%，MgSO4添加量為0.44 g/L，KH2PO4添加量為14.91 g/L，在此最佳條件下產(chǎn)生GABA的理論值為417.196 μg/mL。

為了方便試驗操作，在實際操作中稍作調(diào)整：牛奶乳清粉添加量11 g/L，可溶性固形物為20%，MgSO4添加量為0.4 g/L，KH2PO4添加量為15 g/L，在該條件下進行3組重復(fù)驗證試驗，得到發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度為412.54 μg/mL，與預(yù)測值相差1.1%，這表明采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠。相比于未添加MSG，經(jīng)混菌發(fā)酵后紅棗汁中GABA質(zhì)量濃度的138.17 μg/mL，底物優(yōu)化后使GABA的產(chǎn)量增加。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Experimental results of response surface

表4 響應(yīng)面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface test

2.4 乳酸菌發(fā)酵紅棗汁主要成分變化

2.4.1 發(fā)酵過程中總酸和pH的變化 酸度是發(fā)酵過程的一個重要指標(biāo)[21]，發(fā)酵過程中變化規(guī)律如圖1所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，LB和LP混菌發(fā)酵使總酸質(zhì)量濃度不斷上升，pH不斷降低，這可能是由于乳酸菌不斷繁殖和代謝，使發(fā)酵液中積累大量的酸；當(dāng)發(fā)酵時間超過60 h之后，紅棗汁中低酸環(huán)境和高濃度H+抑制了乳酸菌的生長，使乳酸菌產(chǎn)酸能力受到一定影響[22]。因此在發(fā)酵后期紅棗汁中的總酸和pH變化不大。發(fā)酵時間為60 h時，總酸質(zhì)量濃度從最初的5.81 g/L增加到20.63 g/L，相比于未優(yōu)化前，總酸含量有了顯著的增加。這可能是調(diào)整后的紅棗汁營養(yǎng)物質(zhì)充足，促進了乳酸菌的生長，從而提高了紅棗汁中乳酸產(chǎn)物的積累[19,23]。

2.4.2 發(fā)酵過程中還原糖和總酚的變化 從圖5中可知，隨著發(fā)酵時間的延長，還原糖質(zhì)量濃度在0～60 h迅速下降，60 h后逐漸趨于穩(wěn)定。質(zhì)量濃度下降原因是隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌在紅棗汁中不斷的生長和代謝消耗糖類物質(zhì)，使糖含量快速的下降[24]；60 h后，紅棗汁中乳酸含量增加和糖類物質(zhì)減少抑制了乳酸菌的生長，使還原糖消耗速率逐漸降低；發(fā)酵時間為60 h時，還原糖質(zhì)量濃度從最初的135.42 g/L降低到69.82 g/L。

圖4 發(fā)酵過程中總酸和pHFig.4 Total acid and pH during fermentation

總酚質(zhì)量濃度隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0～60 h內(nèi)，總酚質(zhì)量濃度不斷的增加，可能是發(fā)酵過程中乳酸菌利用紅棗汁中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長，破壞了紅棗本身的一些結(jié)構(gòu)，從而使多酚物質(zhì)溶出[25]；60 h時總酚質(zhì)量濃度最大，從未發(fā)酵前2 279.57 mg/L增加到 3 181.64 mg/L；當(dāng)超過60 h，總酚質(zhì)量濃度逐漸下降，可能是在發(fā)酵的過程中，多酚被微生物代謝產(chǎn)生的一些酶類物質(zhì)水解產(chǎn)生的現(xiàn)象[26]。

圖5 發(fā)酵過程中總酚和還原糖Fig.5 Total phenol and reducing sugar during fermentation

2.4.3 發(fā)酵前后游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 氨基酸不僅是維持機體正常代謝的重要物質(zhì)，而且在食品中有調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用。由表5可知，未發(fā)酵紅棗汁中檢測出14種氨基酸，混菌發(fā)酵后檢測出16種氨基酸，異亮氨酸和絲氨酸在發(fā)酵后均被檢出。其中賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸這3種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有增加，非必需氨基酸中谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。這是由于添加5 g/L的 L-谷氨酸使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇上升，甘氨酸、脯氨酸和絲氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為446.02、189.51、 20.91 mg/hg，與未發(fā)酵的紅棗汁相比質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯上升，且發(fā)酵后氨基酸種類也更加豐富。這說明增加的氨基酸均由乳酸菌發(fā)酵所得，同時經(jīng)過發(fā)酵也使紅棗汁的風(fēng)味更佳[27]。

3 討 論

3.1 底物添加量對GABA的影響

微生物主要利用檸檬酸循環(huán)(TCA)中的一個重要旁路谷氨酸脫羧酶催化底物L(fēng)-谷氨酸進行脫羧反應(yīng)來合成GABA[28]。當(dāng)紅棗汁中MSG添加量在0～8 g/L能夠促進GABA的產(chǎn)生，這是由于MSG水解成Na+和L-谷氨酸，L-谷氨酸作為合成GABA的底物，刺激谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)從而產(chǎn)生 GABA[29]。如果MSG添加量過高，不僅會抑制GABA的產(chǎn)生，還會影響紅棗汁的風(fēng)味和口感，所以MSG最佳添加量為5 g/L，這與Kantachote等[8]研究結(jié)果一致。因此，乳酸菌發(fā)酵紅棗汁時，MSG添加量需控制在一定5 g/L內(nèi)。

表5 紅棗汁發(fā)酵前后游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Free amino acid mass fraction in jujube juice before and after fermentation mg/hg

GABA量還受發(fā)酵液中碳氮源營養(yǎng)成分的影響[30]。因此需要對發(fā)酵液中碳氮源含量進行優(yōu)化，以期增加紅棗汁中GABA的量。添加的葡萄糖能通過TCA循環(huán)代謝為α-酮戊二酸，再經(jīng)谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為谷氨酸，被GAD分解成 GABA，從而促進GABA的積累[31]。本研究結(jié)果也表明適量的碳氮源量會顯著影響紅棗汁 GABA的量，因此調(diào)整紅棗汁中碳氮比量為最佳時，能促進GABA的產(chǎn)生。

3.2 優(yōu)化前后對紅棗汁中主要成分的影響

由于紅棗汁中營養(yǎng)成分有限，會使乳酸菌發(fā)酵受到一定的影響。經(jīng)過優(yōu)化增加了紅棗汁中的營養(yǎng)物質(zhì)，更利于菌體的生長，使發(fā)酵液中總酸質(zhì)量濃度較未優(yōu)化前顯著增加，pH較未優(yōu)化前下降，同時，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后的紅棗汁氨基酸種類和含量均有增加。

4 結(jié) 論

本研究以紅棗汁為原料，利用LP和LB進行混合發(fā)酵，探究乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的最佳條件，以及紅棗汁發(fā)酵前后主要成分的變化。結(jié)果表明，添加5 g/L的MSG、11 g/L乳清粉、調(diào)整可溶性固形物為20%、0.4 g/L的MgSO4、 15 g/L 的KH2PO4、發(fā)酵時間為60 h時，紅棗發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為412.54 μg/mL。發(fā)酵后總酸質(zhì)量濃度為20.63 g/L、pH 3.23、還原糖質(zhì)量濃度 69.82 g/L、總酚質(zhì)量濃度3 181.64 mg/L，相比于未發(fā)酵前紅棗汁中GABA、總酸、酚類物質(zhì)和氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高，使紅棗汁的品質(zhì)優(yōu)于發(fā)酵前。

綜上所述，本研究利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁生產(chǎn)含GABA的飲品，為開發(fā)富含GABA的純天然發(fā)酵飲品提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。