林燊 齊詩儀 章思佳 林棟

〔摘要〕 目的 觀察不同干預時長電針對正常小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB）及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表達的影響。方法 采用隨機數(shù)字表法將36只正常小鼠分為空白組、手針組、電針5 s組、電針10 s組、電針20 s組、電針60 s組，每組6只?？瞻捉M僅模擬抓取過程;手針組針刺小鼠后海穴后立即取針不留針;電針組取后海穴透皮后分別向左右兩側(cè)沿皮針刺，針柄連接電針儀，按組別分別刺激不同時長（5 s、10 s、20 s、60 s），反復15次，頻率2 Hz，強度2 mA，連續(xù)波。連續(xù)干預7 d后，采用Western Blot法檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF及CREB蛋白的表達。結(jié)果 電針5 s組及電針10 s組大腦皮質(zhì)區(qū)CREB表達較空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;電針20 s組及電針60 s組CREB表達較空白組及手針組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）;電針20 s組CREB表達升高較電針5 s、10 s組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）;電針60 s組較電針20 s組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且較其余各組差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF表達各組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)CREB表達變化在電針20 s組（累積刺激5 min）開始起效，而電針5 s組、電針10 s組刺激無法觸發(fā)大腦皮質(zhì)區(qū)響應蛋白的表達，初步推斷電針20 s組為針刺響應時間。

〔關(guān)鍵詞〕 大腦皮質(zhì)區(qū);電針;干預時長;環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.017

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different intervention durations on the expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） and cAMP-response element binding protein （CREB） in the cortex of normal mice. Methods A total of 36 normal mice were divided into a blank group， a hand acupuncture group， an electroacupuncture 5 s group， an electroacupuncture 10 s group， an electroacupuncture 20 s group and an electroacupuncture 60 s group with random number table method， with 6 rats in each group. The blank group only simulated the grasping process. The hand acupuncture group immediately acupunctured Houhai acupoint of the mice and then withdrew the needle without retaining the needle. The electroacupuncture groups acupunctured Houhai acupoint transdermally， and then acupunctured to the left and right side respectively. The needle handle was connected with the electroacupuncture instrument. The groups were stimulated for 5 s， 10 s， 20 s， 60 s， repeated 15 times， frequency 2 Hz， intensity 2 mA， with continuous wave. After continuous intervention for 7 days， Western Blot method was used to detect the expression of BDNF and CREB protein in the cerebral cortex of mice in each group. Results There was no significant difference in the expression of CREB between the electroacupuncture 5 s group and the electroacupuncture 10 s group （P>0.05）. The expression of CREB in electroacupuncture 20 s group and the electroacupuncture 60 s group was significantly different than that in the blank group and the hand acupuncture group （P<0.001）. The increase of expression of CREB in the electroacupuncture 20 s group was significantly different than that of the electroacupuncture 5 s group and the electroacupuncture 10 s group （P<0.001）. The difference between the electroacupuncture 60 s group and the electroacupuncture 20 s group was statistically significant （P<0.05）， and the difference was statistically significant compared with the other groups （P<0.001）. There was no significant difference in the expression of BDNF in the cerebral cortex between groups （P>0.05）. Conclusion The change of CREB expression in the cerebral cortex of mice began to take effect in the electroacupuncture 20 s group （cumulative stimulation for 5 min）， but the stimulation of the electroacupuncture 5 s and 10 s groups could not trigger the expression of response proteins in the cerebral cortex. The preliminary conclusion is that the electroacupuncture 20 s group is the acupuncture response time.

〔Keywords〕 cerebral cortex; electroacupuncture; duration of intervention; cAMP-response element binding protein; brain-derived neurotrophic factor

關(guān)于針刺留針時間的現(xiàn)代研究大多圍繞不同病種，采用不同留針時間，觀察療效差異，目前對于針刺時間量的研究多關(guān)注于針刺效應的“最大化”，尋找針刺效應的“最優(yōu)”特征[1-2]，即大量實驗旨在探尋最佳療效的留針時間，而對于針刺響應時間的研究乏善可陳[3-4]。針刺響應作為針刺效應的始動環(huán)節(jié)，是針刺效應的基礎(chǔ)。故此本研究團隊提出任何方式的體表刺激，首先是引起機體的生物響應（如簡單的神經(jīng)反射等），并在一定條件下繼而產(chǎn)生生物學效應，但并非所有響應都能產(chǎn)生效應，只有產(chǎn)生足量的響應介質(zhì)（或達到一定閾值）才能進一步激活效應系統(tǒng)。因此，本研究擬采用電針不同時長刺激正常小鼠后海穴，觀察小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neur？鄄otrophic factor，BDNF）蛋白的表達的影響，以期探究最短針刺響應環(huán)節(jié)中的最短作用時間，為指導臨床制定治療方案提供部分依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 ?實驗動物

本實驗采用36只SPF級成年雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為25～30 g，喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（閩）2014-005。參照國家實驗動物飼養(yǎng)與使用指南，處于恒溫恒濕環(huán)境（恒定溫度（22±1） ℃，濕度50%），光照黑暗各12 h交替，每天定時給予清潔飼料和飲水。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部頒布的《有關(guān)善待實驗動物的指導性意見》要求，并通過福建中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準。動物實驗全程麻醉、保溫，并檢測心率以確保麻醉深度，動物結(jié)束后過量麻醉處死。

1.2 ?實驗試劑

RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠、5x蛋白上樣緩釋劑、SDS-PAGE電泳液、Western Blot轉(zhuǎn)膜液、5%脫脂牛奶封閉液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），一抗CREB、BDNF（Cell Signaling Technology美國），內(nèi)參β-actin、二抗 Goat Anti-Rabbit IgG（Proteintech生物技術(shù)有限公司）。

1.3 ?實驗儀器

DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）;酶聯(lián)免疫檢測儀（華泰和合（北京）商貿(mào)有限公司）;DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海譜振生物科技有限公司）;VE-180垂直電泳槽（上海郎賦實業(yè)有限公司）;GS-6R Centrifuge冷凍離心機（美國Beckman 公司）; GG/D2凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司）;HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運安特科技有限責任公司）;無菌針灸針（0.30 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）。

2 實驗方法

2.1 ?動物分組及干預方法

本研究依照數(shù)字隨機表法將36只成年雄性ICR小鼠隨機分為空白組、手針組、電針5 s組、電針10 s組、電針20 s組、電針60 s組，每組6只。

2.1.1 ?空白組 ?在干預過程中僅以雙手輕縛模擬抓取過程，1 次/d，連續(xù)7 d。

2.1.2 ?手針組 ?針刺小鼠后海穴（位于尾根與肛門之間的凹陷處），取法參照李忠仁主編的《實驗針灸學》（新世紀第2版）中“常用實驗動物針灸穴位圖”確定小鼠后海穴的具體定位方法。直刺進針深度約6～8 mm，針刺后立即取針不留針。1 次/d，連續(xù)7 d。2.1.3 ?電針組 ?沿后海穴透皮后分別向后海穴左右兩側(cè)沿皮針刺，進針深度約6～8 mm，將左針柄接正極、右針柄接負極至電針儀，頻率2 Hz，2 mA連續(xù)波。設置不同的干預時間：（1）電針5 s組：電刺激5 s，間歇2 min，再刺激5 s，反復15次;（2）電針10 s組：電刺激10 s，間歇2 min，再刺激10 s，反復15次;（3）電針20 s組：電刺激20 s，間歇2 min，再刺激20 s，反復15次;（4）電針60 s組：電刺激60 s，間歇2 min，再刺激60 s，反復15次。進針及留針期間將小鼠以黑布蒙頭，以手輕微束縛。1 次/d，連續(xù)7 d。

2.2 ?Western Blot法檢測相關(guān)指標

將樣本置于新的EP管稱重記錄，按比例加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑后研磨、靜置、離心，取上清液采用BCA蛋白濃度檢測法定量檢測。取出部分上清液加入5x蛋白上樣緩沖液振蕩混勻，放置在95 ℃金屬浴恒溫儀器中加熱5 min使得蛋白質(zhì)變性。用10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠在適當條件下進行電泳，結(jié)束后將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。取出轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用TBST清洗，5%脫脂牛奶封閉液封閉、再用TBST清洗，而后加入按比例稀釋的一抗CREB（1∶1 000）、BDNF（1∶1 000）、內(nèi)參β-actin（1∶1 000），在4 ℃條件下孵育過夜。在TBST清洗后加入稀釋過的二抗山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），室溫孵育。最后在暗室中用顯影液反應1 min進行顯影、定影。

2.3 ?統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 20進行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果以“x±s”表示，每組樣本測得數(shù)據(jù)均行正態(tài)分布及方差齊性檢驗。組間差異性比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。

3 結(jié)果

如圖1示，電針小鼠后海穴電針5 s組及電針10 s組皮質(zhì)區(qū)CREB 蛋白變化與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;電針20 s組及電針60 s組干預后皮質(zhì)區(qū)CREB 蛋白的表達與空白組及手針組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001），且電針20 s組皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達升高較電針5 s、10 s組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001），而電針60 s組與電針20s組比較存在顯著性差異（P<0.05），與其余各組間均差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。皮質(zhì)區(qū)BDNF蛋白表達量各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

4 討論

目前，對于針刺時間因素上的量的效應關(guān)系研究旨在尋找針刺效應的“最優(yōu)”特征[1-2]。張棟等[2]通過熱像圖研究周圍性面癱患者不同留針時間的時效差異發(fā)現(xiàn)，留針20 min相比于留針10 min、留針30 min，能獲得局部溫度提升和維持時間雙優(yōu)化的療效。陳少宗等[5]發(fā)現(xiàn)針刺期門穴對慢性膽囊炎低張力型患者留針10 min時起效，40 min時最佳。

然而，本研究團隊則認為針刺效應不同于針刺響應，針刺效應是基于針刺響應基礎(chǔ)上達到生物機能調(diào)控，是機體對適當?shù)捏w表刺激作出的深度反饋，這一過程固然存在一定的量效關(guān)系。但針刺響應作為針刺效應的始動環(huán)節(jié)，是體表穴位刺激的第一環(huán)節(jié)，從穴位反應到機體效應，有著復雜的干預因素及作用層次。這正如李鑫舉等[6]提出針刺反應與針刺效應不同，并非所有的針刺反應都能引起針刺效應。

本研究所討論的最短針刺時長是基于針刺量效關(guān)系中的第一階段針刺響應時間而言，而其最短響應時間則與干預時長、刺激方式、刺激強度等存在一定關(guān)系。本研究是基于項目組獲得授權(quán)的專利成果“一種基于生物反饋技術(shù)的自閉癥穴位刺激治療儀”而展開的，電針組的時間設置是基于本團隊前期對于自閉癥兒童的眼電監(jiān)測研究，觀察自閉癥兒童在注視物體時瞳孔大小及眼球運動特征會發(fā)生變化，且監(jiān)測眼動電活動結(jié)果顯示在2 min內(nèi)至少可發(fā)現(xiàn)一次有意義的眼動電活動特征。因此，本研究通過電針不同時長干預正常小鼠以觀察針刺響應的表達，僅針對針刺量效關(guān)系第一階段的針刺響應過程，并探討其電針刺激后的響應時長。同時通過設立手針組觀察不同針刺干預方式間的差異，本研究結(jié)果表明，手針組僅與電針5 s、20 s、60 s組之間CREB蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而手針組與空白組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明手針刺激并未起到顯著性效應，僅作為干預方式的參考，比較刺激方式的不同，為后繼實驗提供參考依據(jù)。項目組擬計劃在后繼研究中進一步針對不同病理狀態(tài)（如自閉癥模型）、不同干預方式開展針刺響應到針刺效應之間的量效關(guān)系研究。

CREB位于胞內(nèi)，介導了對神經(jīng)的保護作用[7]。CREB在作為繼發(fā)于外源性刺激的信號蛋白，能應激的表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程中承擔重要的角色。齊詩儀等[8]發(fā)現(xiàn)電針后海穴能促進FMR1基因敲除小鼠腦組織中CREB蛋白的表達。林棟等[9]研究表明，針刺外關(guān)穴20 min能促進正常大鼠腦內(nèi)CREB的表達，在針刺與無針刺之間有顯著差異。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺干預能激活正常大鼠及病理模型大鼠腦內(nèi)響應蛋白CREB表達，因此，可認為CREB作為一種繼發(fā)于針刺刺激的響應蛋白，能充分體現(xiàn)針刺干預的響應與否。本研究結(jié)果表明，電針20 s組皮質(zhì)CREB蛋白表達較空白組、手針組、電針5 s、10 s組均存在差異，差異電針20 s（累積刺激5 min）起已開始起效，而以5 s及10 s為單位的刺激無法觸發(fā)相關(guān)腦區(qū)的響應蛋白表達，故可初步推斷電針20 s組為針刺響應時間。而電針60 s組與其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明其已屬針刺效應的上升期并非針刺響應時間。至于10～20 s之間是否存在響應時間，有待后續(xù)實驗觀察。

BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成并廣泛存在于各種腦組織，其中以腦皮層及海馬中含量最高[10-11]。BDNF 可選擇性調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、存活、遷移。有研究表明[12]，針刺足三里30 min能促進端粒酶基因敲除小鼠小腦BDNF表達增加。王東巖等[13]研究表明，電針大鼠前三里穴和外關(guān)穴20 min能促進腦梗死大鼠缺血區(qū)BDNF表達上升。本研究結(jié)果表明，電針不同干預時長對于正常小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF蛋白表達各組間變化無顯著性差異。研究團隊認為其原因可能為BDNF是一種保護修復損傷腦組織的蛋白，其表達含量與實驗模型疾病狀態(tài)相關(guān)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)[14]，針刺刺激能顯著提升端粒酶敲除小鼠BDNF表達，而對于野生型小鼠并未發(fā)現(xiàn)該變化。這表明針刺響應所激活的效應物質(zhì)與機體的病理狀態(tài)相關(guān)，這一點是針刺效應與效應不同的基本特征。

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