高婭蓉，熊康寧，袁周偉，苑曉偉，譚 超，陳曉曉，宋月華

(貴州師范大學 喀斯特研究院/國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽 550001)

【研究意義】DNA條形碼 (DNA Barcoding) 技術是昆蟲基因組中一段被公認的、相對較短的DNA序列進行物種鑒定的一種分子生物學技術，可以快速、準確鑒定物種，對物種分類和系統(tǒng)發(fā)育研究有著重要意義[1]。種屬的分類鑒定是小葉蟬亞科昆蟲研究的重要內容，受形態(tài)學鑒定與傳統(tǒng)分類的局限，葉蟬分類學的發(fā)展急需新技術的支撐[2]。DNA條形碼的分子分類方法能夠彌補傳統(tǒng)形態(tài)學分類的缺憾[3]?！厩叭搜芯窟M展】基于線粒體DNA COI基因的條形碼技術的物種鑒定手段在其他類昆蟲鑒定中已有廣泛應用[4-7]。張媛等[8]對鞘翅目昆蟲COI基因的序列分析和系統(tǒng)進化樹的構建指出，DNA條形碼技術在鞘翅目昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的應用價值。戴仁懷等[9]基于線粒體COI基因對中國常見的廣頭葉蟬亞科種類進行系統(tǒng)發(fā)育研究，為物種快速鑒定打下了基礎。胡澤章等[10]研究證明，運用DNA條形碼技術對小花蝽屬昆蟲進行物種快速分子鑒定是可行的。【本研究切入點】應用于DNA條形碼工作中的基因很多，但線粒體細胞色素C氧化酶亞基基因(COI)擁有相對保守性的特點，種間變異較大，合適的序列長度能提供豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，是目前測序最多、結構和進化動力學研究較清楚的基因，已被廣泛應用于近緣種間的系統(tǒng)分類研究[11]。小葉蟬亞科為葉蟬科第二大亞科，種類很多，而在小葉蟬亞科的低級階元，近緣種普遍存在，根據(jù)傳統(tǒng)分類學方法很難區(qū)分，采取新的特征和手段，可為近似種的鑒定提供更為可靠的證據(jù)?！緮M解決的關鍵問題】應用DNA條形碼技術對小葉蟬亞科物種進行鑒定，旨在彌補小葉蟬亞科傳統(tǒng)分類方法的不足[12]，為近似種難以從形態(tài)上鑒定區(qū)分的問題提供更為可靠的依據(jù)[13]，該鑒定方法快速、方便且準確，對物種精確鑒定、生物多樣性評估和系統(tǒng)發(fā)育關系方面的研究具有重要意義和科學價值[14]。為能快速、準確地鑒定小葉蟬亞科種類，通過PCR擴增對小葉蟬亞科5個族的線粒體COI基因片段序列進行測序和比對，然后將同源序列的堿基多樣性及系統(tǒng)進化關系進行分析[15]，探討線粒體COI基因片段作為DNA條形碼準確鑒定小葉蟬亞科昆蟲種類的可行性，以期為更進一步研究小葉蟬亞科昆蟲分子鑒定技術提供理論依據(jù)和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

葉蟬標本于2017年8月和2018年6月在貴州梵凈山國家自然保護區(qū)采集，浸泡于無水乙醇中，保存于貴州師范大學喀斯特研究院6樓實驗室，-20 ℃冰箱備用。選取的2種標本類型分別編號為YXYC(眼小葉蟬族Alebrini)與 XLYC(小綠葉蟬族Empoascinisp.)。對比COI基因序列源于從基因庫GenBank中下載的20種小葉蟬亞科昆蟲COI基因序列(表1)。

動物組織快速提取試劑盒 (VWI)Easy Pure Genomic DNA kit，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取出無水乙醇保存的葉蟬標本，除去腹部和翅膀，然后將其余的動物組織使用無菌研磨棒將其磨成粉末狀置于無菌的1.5 mL離心管中，然后按照動物組織快速提取試劑盒說明書提取總DNA，檢測樣品的濃度和純度后馬上保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 COI基因擴增及測序 ①引物合成。通過文獻查找篩選適合的COI通用引物[16]，引物均由上海生物工程有限公司合成。COI引物分為COIF(上游引物)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；COIR(下游引物)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。②PCR反應體系。2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，加ddH2O 21 μl，總共50 μl。PCR主要反應過程：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共有34個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后由上海生物工程有限公司進行直接測序。

1.2.3 序列處理與分析 測序后得到的結果使用Chromas進行讀取與確認。運用MEGA6.0進行序列的拼接與手工校正，確定分析的序列[17]。利用NCBI中的BLAST進行相似性檢索，確定序列方向及目的片段；將確定的序列及Genbank中下載的20種小葉蟬的基因序列載入Clustal X 1.83[18]進行序列比對，輸出格式為FASTA。比對結果導入MEGA6.0[19]計算各物種間的遺傳距離[20]，轉換和顛換值及其比值(R值)，保守位點(Conserved sites，C)及變異位點(Variable sites，V)等數(shù)值[21]?；贛EGA6.0運用鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)與Kimura 2-parameter遺傳距離模型[22]分析20種小葉蟬物種同2個外群物種YXYC(眼小葉蟬族)與XLYC(小綠葉蟬族)間的遺傳距離和采用Bootstrap重復抽樣1000次用以檢驗分子系統(tǒng)樹每個分支的置信度，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 COI基因序列組成與變異

葉蟬測序得到的結果及基因庫下載的相關小葉蟬序列運用MEGA6.0拼接剪切成統(tǒng)一長度(646 bp)的片段，沒有出現(xiàn)缺失和插入的情況。變異位點為512個，保守位點134個，簡約信息位點415個，自裔位點97個。整個序列結構中A、G、C和T堿基組成的含量分別為27.6 %、15.5 %、15.3 %和41.6 %。A+T含量為69.2 %，明顯高于G+C含量，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏好，滿足昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征[23]。

表1 小葉蟬亞科線粒體COI基因片段信息

2.2 堿基替換

從表2看出，全部位點的轉換產生于T和C間，顛換主要發(fā)生在A與T間，轉換/顛換比值(R)為0.63。密碼子位點分析，轉換與顛換主要產生在密碼子第3位點，R為0.81，轉換與顛換數(shù)值鄰近，符合昆蟲線粒體特別屬性，替換主要產生在密碼子第3位點。第1位點、2位點和第3位點的R分別為0.58、0.57和0.81。整體與密碼子各位點的R均小于2，表明該段序列的轉換與顛換沒有達到飽和，一般在建立系統(tǒng)發(fā)育樹時需要考慮轉換與顛換的發(fā)生比率；說明該段基因準確度高，運用該基因得到的進化樹是具有準確性的。

2.3 遺傳距離

從表3看出，小綠葉蟬族葉蟬物種間的遺傳距離為0.021～0.284，眼小葉蟬族間的種內改為間遺傳距離刪除相差最大，為2.57。不同葉蟬物種間的遺傳距離在0.292～6.183，物種間的平均遺傳距離為0.204，其中近緣種叉脈葉蟬族與小葉蟬亞科間的遺傳距離最小，為0.017；蛇葡萄斑葉蟬和眼小葉蟬族間的遺傳距離最大，為7.491。由此可知，相同葉蟬物種間不受地理位置的影響；葉蟬同一屬種的種間遺傳距離差異較明顯，將此段序列運用于分析和鑒別物種的依據(jù)具有可行性。

表2 小葉蟬亞科的核苷酸堿基替換值

表3 22種小葉蟬種內的種間遺傳距離及標準誤差

注：對角線以下為遺傳距離， 對角線以上為標準誤差。1，眼小葉蟬族；2，叉脈葉蟬族；3，凱小綠葉蟬；4，馬鈴薯小綠葉蟬；5，小葉蟬亞科；6，茶小綠葉蟬；7，小葉蟬亞科；8，叉脈葉蟬族；9，假眼小綠葉蟬；10，蛇葡萄斑葉蟬；11，小葉蟬亞科；12，小葉蟬亞科； 13，小綠葉蟬屬；14，小綠葉蟬屬；15，小綠葉蟬屬；16，切爾塔斑葉蟬；17，小綠葉蟬屬；18，蛇葡萄斑葉蟬；19，小綠葉蟬屬；20，小綠葉蟬屬；21，番木瓜小綠葉蟬；22，小綠葉蟬屬。

Note：The values below the diagonal and above the diagonal are genetic distance and standard error respectively.. 1,Alebrini；2,Dikraneurini; 3,Empoascakaicola; 4,Empoascafabae; 5, Typhlocybinae; 6,Empoascaonukii; 7, Typhlocybinae; 8,Dikraneurasp.; 9,Empoascavitis; 10,Erythroneuratricincta; 11, Typhlocybinae; 12, Typhlocybinae ; 13,Empoascasp.; 14,Empoascasp.; 15,Empoascasp.; 16,Erythroneuracerta; 17,Empoascasp.; 18,Erythroneuratricinct; 19,Empoascasp.; 20,Empoascasp.; 21,Empoascapapaya; 22,Empoascasp.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

從圖1看出，兩種外群YXYC(眼小葉蟬族Alebrini) 與XLYC(小綠葉蟬族Empoascinisp.)位于樹的基部，說明，叉脈葉蟬族和眼小葉蟬族種類親緣關系較近且較原始，這與形態(tài)學分類相一致。與內群其他小葉蟬亞科種類分開。不同兩個外群種均屬小葉蟬亞科，聚為同一支，形成姐妹群，且分支自展值均為 100 %；在內群中，近緣種能聚集在一起，如MF931089和KR567994兩個未分類的小葉蟬種類，其置信度也很高(≥97 %)。同族間的KJ867505和KJ867506親緣關系最相近，不同種的KR564575和KR570673差異明顯?？偟膩碚f，葉蟬種類間的親緣關系與形態(tài)學的劃分基本一致。

3 討 論

對小葉蟬亞科的COI基因序列進行拼接與手工校正，并采用基因庫中Blast進行序列的相似性分析結果表明，所測序列都屬于小葉蟬亞科，COI基因序列且同源性均在98 %以上，說明此段序列準確性強、可信度高。同時，在小葉蟬亞科中，眼小葉蟬族和叉脈葉蟬族的親緣關系較近，而小綠葉蟬族和斑葉蟬族的親緣關系較遠。以線粒體基因COI序列信息為基礎的DNA條形碼技術能有效地對形態(tài)特征變異豐富的小葉蟬亞科昆蟲進行物種鑒定[24]。在此基礎上，采用Kimura 2-parameter 雙參數(shù)模型建立而成的NJ樹，相同葉蟬物種類型聚為同一小支，且分支自展值為100 %；葉蟬物種間的近緣種聚集在一起，置信度相對較高(≥97 %)；不同葉蟬物種間差異表現(xiàn)較明顯，置信度較高，系統(tǒng)進化樹得出的結果與葉蟬的形態(tài)學分類結果基本一致，可以滿足葉蟬種類分類鑒定的需要?；诰€粒體COI基因的DNA條形碼技術是可以作為小葉蟬亞科物種鑒定的有利工具，對小葉蟬亞科昆蟲分子鑒定具有可行性。

分支處上方數(shù)值表示重復1000次后的自展值The value above branches is bootstrap value (1000 replicates)

4 結 論

葉蟬測序得到的結果及基因庫下載的相關小葉蟬序列運用MEGA6.0拼接剪切成統(tǒng)一長度(646 bp)的片段，沒有出現(xiàn)缺失和插入的情況。變異位點為512個，保守位點134個，簡約信息位點415個，自裔位點97個。整個序列結構中A、G、C和T堿基組成的含量分別為27.6 %、15.5 %、15.3 %和41.6 %。A+T含量為69.2 %，明顯高于G+C含量，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏好，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。轉換與顛換結果顯示：該段序列沒有飽和，可以得到準確的進化分析。同物種間與不同物種間的遺傳距離分別為0.025～0.044和0.024～0.291，平均為0.358?；贑OI基因序列構建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)顯示，同一物種聚為同一小支，分支自展值均為100 %：近緣種能聚集在一起，且置信度很高(≥97 %)。結果表明，昆蟲COI序列能夠區(qū)分不同物種，COI基因片段的DNA條形碼進行小葉蟬亞科昆蟲分類鑒定具有可行性。