王莎，劉斯琪，丁鵬敏，龐月笙，陶志，王如峰

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

廣義的藥物代謝，也就是藥物的體內(nèi)過(guò)程，是指機(jī)體對(duì)藥物的處置過(guò)程，包括吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和排泄（excretion）4 個(gè)階段。代謝使藥物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其活化、失活、解毒或增毒，因此，藥物代謝對(duì)藥效和毒性有重要影響[1]。藥物代謝研究在提高藥物療效、安全合理用藥、新藥研發(fā)等方面的意義不可忽視。中藥由于其成分復(fù)雜，療效和毒副作用受代謝過(guò)程的影響更大，其中涉及化學(xué)成分的修飾、成分之間以及成分與人體內(nèi)原有物質(zhì)的相互作用等。通過(guò)追蹤中藥成分的體內(nèi)過(guò)程，結(jié)合藥理活性研究，可以發(fā)現(xiàn)和辨識(shí)中藥的有效成分，有助于闡明藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制。中藥成分代謝研究分動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外模擬實(shí)驗(yàn)2 種方式。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)直接采用活體動(dòng)物作為研究載體，其研究結(jié)果更接近中藥成分在人體內(nèi)的真實(shí)情況。然而，由于動(dòng)物體內(nèi)過(guò)程的影響因素較多，體內(nèi)成分及其代謝產(chǎn)物微量，現(xiàn)有檢測(cè)和分析技術(shù)的局限性，以及種屬差異導(dǎo)致的代謝途徑和代謝酶的差異等，限制了其在中藥代謝特別是代謝機(jī)制研究中的應(yīng)用。但是，體外模擬實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)組合藥物代謝模型模擬中藥成分在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程，再結(jié)合藥理活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)活性代謝產(chǎn)物并闡明其作用機(jī)制，彌補(bǔ)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的不足。

體外模型通常具有替代（replacement）、簡(jiǎn)化（reduction）、精準(zhǔn)（refinement）等特點(diǎn)[2]。首先，用體外研究替代動(dòng)物體內(nèi)研究能降低成本、簡(jiǎn)化操作、精確控制。其次，體外研究排除了體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，避免了動(dòng)物個(gè)體差異，對(duì)藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制的研究更加精確。再次，體外研究可通過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)得到足量代謝產(chǎn)物，用于準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性研究。最后，通過(guò)體外研究還可預(yù)測(cè)和完善體內(nèi)研究的結(jié)果，兩者為互補(bǔ)關(guān)系。但是，需要對(duì)體外模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以便最大程度地模擬生物體內(nèi)的實(shí)際狀況。不同體外模型也各有其特點(diǎn)和局限性，在中藥代謝研究中應(yīng)有選擇地使用。

1 體外吸收模型及其應(yīng)用

口服藥物的主要吸收?qǐng)鏊切∧c，其研究方法分為體外（in vitro）、原位（in situ）和體內(nèi)（in vivo）法。目前藥物腸吸收的體外研究方法主要有2 類，一類是通過(guò)分離動(dòng)物腸黏膜或腸段來(lái)評(píng)價(jià)藥物腸吸收，另一類是通過(guò)分離人腸細(xì)胞并給予模擬的腸環(huán)境來(lái)分析藥物的腸吸收。常用的體外腸吸收模型有大鼠腸囊模型和細(xì)胞培養(yǎng)模型，另外還包括尤斯灌流室模型（Ussing chamber）、平行人工膜滲透模型（parallel artificial membrane permeability analysis，PAMPA）、溶出/吸收仿生系統(tǒng)模型（drug dissolution and absorption simulating system，DDASS）等。

1.1 常用的體外吸收模型

1.1.1 大鼠腸囊模型

大鼠腸囊模型包括外翻腸囊模型和非外翻腸囊模型。前者應(yīng)用較多，后者由于腸囊內(nèi)部空間狹小、通氣條件不易控制、滲透到外測(cè)的藥物濃度低導(dǎo)致檢測(cè)困難等原因而應(yīng)用較少。外翻腸囊模型被用于胃腸段的藥物吸收、代謝、外排轉(zhuǎn)運(yùn)、多藥耐藥性以及藥物相互作用等研究。該模型的優(yōu)點(diǎn)是吸收表面積較大和存在黏液層；其缺陷在于：翻轉(zhuǎn)小腸時(shí)易造成形態(tài)破壞，因缺乏血液供應(yīng)易導(dǎo)致全腸段失活，只能觀察藥物透過(guò)腸壁的濃度，無(wú)法計(jì)算較詳盡的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。

外翻腸囊模型適合于藥物的分段吸收研究，例如在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收。根據(jù)采用該模型進(jìn)行的研究結(jié)果，中藥成分大部分在十二指腸和空腸被吸收，少部分在回腸被吸收，極少部分在結(jié)腸被吸收[3-5]。外翻腸囊模型也可作為一種預(yù)測(cè)中藥有效成分的工具，有學(xué)者采用該模型研究了吳茱萸湯的吸收成分，結(jié)合藥效學(xué)結(jié)果推測(cè)吳茱萸堿和吳茱萸次堿是吳茱萸湯治療偏頭痛的有效成分[6]。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)模型

研究藥物吸收的細(xì)胞模型較多，主要包括Caco-2、HT29-MTX、MDCK、MDCK-MDR1 等。

1.1.2.1 Caco-2 細(xì)胞模型 Caco-2 細(xì)胞系來(lái)源于人結(jié)腸腺癌（human colon adenocarcinoma）上皮細(xì)胞，它在體外培養(yǎng)過(guò)程中可以自行分化成單層細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)以及滲透性等方面與人成熟的小腸上皮細(xì)胞類似。Caco-2 細(xì)胞模型在20 世紀(jì)80 年代后期建立，是首個(gè)被國(guó)外制藥企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室推廣的腸吸收細(xì)胞模型，2002 年被國(guó)際認(rèn)定為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于藥物的腸吸收研究[7]。該模型用帶聚碳酸酯膜的Transwell 孔板構(gòu)建，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)基DMEM 比基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEM 更適合該模型[8]。楊秀偉等[9]對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)、種板、相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)等研究后制定了Caco-2 細(xì)胞模型標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。

Caco-2 細(xì)胞可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化且可形成緊密連接，形成腸腔側(cè)（頂端絨毛面）和腸壁側(cè)（底端基底面），并表達(dá)刷狀緣肽酶、某些細(xì)胞色素酶和異構(gòu)酶，這些特點(diǎn)使其適用于吸收特性和機(jī)制研究。筆者團(tuán)隊(duì)采用該模型研究了金蓮花化學(xué)成分的腸吸收，發(fā)現(xiàn)酚酸類和生物堿類比黃酮類更易被吸收，并且黃酮類的吸收機(jī)制與其母核C-7、C-2 和C-3 位上的取代基有關(guān)[10-12]。然而，由于Caco-2 細(xì)胞來(lái)源于人的結(jié)腸癌，仍與小腸黏膜存在差異，例如Caco-2 細(xì)胞單層缺少黏液層，代謝酶組成和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量也與小腸黏膜有區(qū)別。鑒于此，有研究者對(duì)Caco-2 細(xì)胞模型進(jìn)行了改進(jìn)和完善，Lozoya-Agullo 等[13]將 Caco-2/HT29-MTX 共培養(yǎng)、Caco-2/HT29-MTX/Raji-B 三重培養(yǎng)并用模型藥物進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)、三重培養(yǎng)模型更適合藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究。鄧旭東[14]將Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)于聚醚砜（PES）中空纖維內(nèi)，構(gòu)建了一種新型的中空纖維反應(yīng)器，細(xì)胞在7 d 內(nèi)完成功能分化，其藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)能力與傳統(tǒng)Caco-2 模型相當(dāng)。

1.1.2.2 HT29-MTX 細(xì)胞模型 HT29-MTX 細(xì)胞模型是HT29 細(xì)胞系（來(lái)源于人結(jié)腸癌細(xì)胞）與甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）共培養(yǎng)后形成。該模型含有分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞，可模擬小腸的黏液層，用于研究腸黏液對(duì)被吸收藥物的影響。與Caco-2 細(xì)胞相比，HT29-MTX 中的杯狀細(xì)胞增強(qiáng)了對(duì)親脂性化合物的吸收[15]。Gagnon 等[16]對(duì)Caco-2、HT-29、HT29-MTX 細(xì)胞模型進(jìn)行了比較研究，證明HT29-MTX 細(xì)胞模型比較適合于細(xì)胞與病原體的相互作用研究。

1.1.2.3 MDCK 細(xì)胞模型 MDCK 細(xì)胞系來(lái)源于馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞，由Madin S H 和Darby N B于1958 年從成年雄性西班牙獵犬的腎臟獲取[17]。MDCK 接種于 Transwell 半透膜上 2 ～ 6 d 即能分化成柱狀單層上皮細(xì)胞并形成致密連接，是較為理想的上皮細(xì)胞系[18]。在主動(dòng)吸收藥物的滲透性研究中，MDCK 細(xì)胞模型的表觀滲透系數(shù)（Papp）與Caco-2 細(xì)胞模型的Papp有良好相關(guān)性，兩者包含的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體及攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體區(qū)別較大[19]。綜合比較而言，MDCK 細(xì)胞模型更適用于快速膜通透性篩選，也常用作血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）模型。MDCK-MDR1 是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將多藥耐藥基因 1（multidrug resistance gene 1，MDR1）轉(zhuǎn)染至MDCK 細(xì)胞所建立的穩(wěn)定高表達(dá)人源P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的細(xì)胞系。將MDCKMDR1 細(xì)胞接種于Transwell 的聚碳酸酯膜上生長(zhǎng)形成極化的細(xì)胞層，可作為研究藥物雙向轉(zhuǎn)運(yùn)、快速篩選、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和預(yù)測(cè)體內(nèi)吸收的模型[20]。胡亞等[21]通過(guò)MDCK-MDR1 細(xì)胞模型研究了馬錢子生物堿類成分的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)馬錢子堿、士的寧的吸收以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，可能是P-gp 的底物。

綜上所述，細(xì)胞模型在藥物腸吸收研究中應(yīng)用相對(duì)較多，不同細(xì)胞培養(yǎng)模型適用范圍不同（見(jiàn)表1），在具體應(yīng)用中可根據(jù)研究目的靈活選擇。

表1 藥物腸吸收細(xì)胞模型比較Table 1 Comparison of drug intestinal absorption cell models

1.1.3 尤斯灌流室模型

尤斯灌流室模型由Ussing 于1951 年提出，經(jīng)過(guò)多年發(fā)展已應(yīng)用于藥物吸收、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種研究領(lǐng)域。該模型操作簡(jiǎn)捷，可對(duì)藥物腸段特定位置的吸收與分泌過(guò)程，以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的不同階段進(jìn)行研究[25]。通過(guò)微電極檢測(cè)細(xì)胞膜的電生理變化，該模型可測(cè)量藥物在上皮細(xì)胞及脈絡(luò)膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)。該模型既可采用動(dòng)物的上皮組織細(xì)胞，也可采用培養(yǎng)的上皮細(xì)胞，適合研究藥物的吸收特性和動(dòng)力學(xué)，常用于吸收成分的初篩。李明華等[26]采用該模型發(fā)現(xiàn)，京大戟提取物與紫杉醇合用能提高紫杉醇的生物利用度。另有研究者采用該模型研究了兩色金雞菊4 種代表成分在大鼠腸道中的吸收，發(fā)現(xiàn)這4 種成分均可被吸收[27]。尤斯灌流室也可以與樣品前處理和檢測(cè)設(shè)備在線串聯(lián)，例如尤斯灌流室-固相萃取-高效液相色譜（Ussing chamber-SPE-HPLC）平臺(tái)，可提高活性成分的篩選效率[28]。

1.1.4 其他腸吸收體外模型

其他腸吸收體外模型有PAMPA、DDASS 等。PAMPA 將人造磷脂作為生物膜模擬藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)藥物膜透過(guò)進(jìn)行研究。該模型能進(jìn)行高通量藥物測(cè)定，成本低、靈活性好、檢測(cè)方便快捷[29]，但是，只能檢測(cè)以被動(dòng)擴(kuò)散為吸收方式的藥物。DDASS 將藥物體外溶出模型和跨膜透過(guò)模型有機(jī)結(jié)合，可用于表征藥物變化規(guī)律的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，闡明不同生理狀況對(duì)藥物釋放度和吸收率的影響[30]。

1.2 體外吸收模型在中藥研究中的應(yīng)用概況

對(duì)于中藥及其復(fù)方研究而言，體外吸收模型是降低研究復(fù)雜性、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟的一種有效手段，也可以視作有效成分的初篩工具。目前，中藥成分腸吸收研究集中在判斷化學(xué)成分的吸收難易程度、吸收機(jī)制以及吸收過(guò)程中的相互作用等方面。其中，重點(diǎn)關(guān)注的是活性成分的吸收難易或吸收后含量高的成分，而對(duì)于中藥復(fù)方的整體腸吸收研究較少且欠深入。這主要是由于中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，檢測(cè)手段難以滿足所致。然而，中藥是多種成分的復(fù)合體，微量成分的療效貢獻(xiàn)現(xiàn)在還沒(méi)有定論，僅關(guān)注主要成分是否能準(zhǔn)確反映中藥的真實(shí)藥效有待進(jìn)一步考察。

多種體外模型聯(lián)用是目前中藥體外腸吸收研究的有效方式，因?yàn)楦鞣N模型來(lái)源不同，在細(xì)胞組織特性、轉(zhuǎn)運(yùn)體的種類和數(shù)量方面與真實(shí)小腸黏膜存在差異。多模型聯(lián)用可以相互補(bǔ)充，更接近真實(shí)的藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。筆者團(tuán)隊(duì)通過(guò)外翻腸囊模型、Caco-2 細(xì)胞模型對(duì)金蓮花的有效成分進(jìn)行了研究，結(jié)果證明除了黃酮類之外，酚酸類和生物堿類也是金蓮花的主要體內(nèi)活性成分[31]。有研究者通過(guò)體外-生物信息學(xué)-體內(nèi)（in vitro-in silico-in vivo）聯(lián)合策略研究了梔子大黃湯的吸收特性及不同組分的相互作用，明確了湯劑的吸收成分，并證明不同成分間存在相互作用[32]。

2 體外分布模型及其應(yīng)用

藥物被吸收后，以游離狀態(tài)或結(jié)合狀態(tài)隨血液循環(huán)分布到各組織間液和細(xì)胞內(nèi)液。在藥物分布過(guò)程中，會(huì)受到各種屏障如BBB 和胎盤屏障（placental barrier）的阻礙，藥物透過(guò)這些屏障的能力是影響其分布的重要因素。

2.1 常用的體外分布模型

目前，藥物體外分布模型研究中較為成熟的是BBB 體外模型，研究BBB 對(duì)藥物分子的透過(guò)作用有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的篩選和開(kāi)發(fā)[33]。目前已建立了多種BBB 體外模型，例如Transwell 模型、永生化內(nèi)皮細(xì)胞模型、三維（3D）微流體模型、微流控芯片模型等。

2.1.1 Transwell 培養(yǎng)模型

Transwell 培養(yǎng)模型可分為單細(xì)胞培養(yǎng)Transwell模型、共培養(yǎng)Transwell 模型、三培養(yǎng)Transwell 模型。單細(xì)胞培養(yǎng)Transwell 模型是最簡(jiǎn)單的BBB 體外模型，通過(guò)在靜態(tài)條件下，將單層腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于可滲透支架上而得到。該模型比較穩(wěn)定、成本低、允許細(xì)胞遷移，但缺少與周圍細(xì)胞群之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且靜態(tài)培養(yǎng)無(wú)法模擬體內(nèi)BBB的血流、剪切力等[34]。為彌補(bǔ)單細(xì)胞培養(yǎng)的不足，共培養(yǎng)模型將星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，形成的屏障作用更加緊密。三培養(yǎng)模型是將神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞與周細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。三培養(yǎng)Transwell 模型跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻明顯升高，緊密連接蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與體內(nèi)環(huán)境更相似[35]。

2.1.2 永生化內(nèi)皮細(xì)胞模型

永生化細(xì)胞是能保留親代細(xì)胞特性且增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞。Rahman 等[36]總結(jié)了36 種利用永生化內(nèi)皮細(xì)胞建立的BBB 模型，應(yīng)用較廣的是人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3、大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系RBE4 和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3。hCMEC/D3 能夠表達(dá)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）、P-gp、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等多種酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體。RBE4 可表達(dá)幾乎所有腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征標(biāo)志物，應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌因子及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究[37]。Cecchelli 等[38]建立了一種由臍帶血造血干細(xì)胞分化出的人腦內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞共培養(yǎng)的BBB 模型，該模型穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，具有良好的體內(nèi)外相關(guān)性。

2.1.3 3D 微流體模型

微流體模型是基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）的模型系統(tǒng)，目前已構(gòu)建出多種微流體BBB 模型[39]。其中一種利用PDMS 制作了由微通道相互連接的16 個(gè)獨(dú)立功能單元，每個(gè)功能單元由4 個(gè)均一的BBB 模型組成。另一種是將2 個(gè)微通道彼此獨(dú)立地進(jìn)行共培養(yǎng)，分別作為BBB 外部和內(nèi)部的微環(huán)境。此外，還有三層PDMS 加上分隔2 個(gè)腔室的PC 膜及微流體芯片等多種模型。其中，微流體芯片模型在BBB 研究中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)通過(guò)連接功能單元和通道網(wǎng)絡(luò)來(lái)操縱微流體，實(shí)現(xiàn)微小芯片上的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等操作[40]。利用微流控芯片技術(shù)構(gòu)建易調(diào)控，接近在體微環(huán)境的體外BBB 模型具有成本低、可控、高通量和可長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[41]。3D 微流體模型不僅將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及周細(xì)胞等多種細(xì)胞以管狀結(jié)構(gòu)包括在內(nèi)，還考慮到變量因素，如腦皮層毛細(xì)血管微血流及內(nèi)皮細(xì)胞間的剪切力。該模型更接近于體內(nèi)環(huán)境，但是制作成本高，高通量模型制備困難，實(shí)驗(yàn)操作對(duì)結(jié)果影響較大，并且尚處于早期開(kāi)發(fā)階段，有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 體外分布模型在中藥研究中的應(yīng)用概況

BBB 體外模型在中藥研究中的應(yīng)用主要涉及2 個(gè)方向：一是中藥藥效成分通過(guò)抑制病理狀態(tài)下BBB 通透性來(lái)發(fā)揮機(jī)體保護(hù)作用，例如有研究證明黃芪甲苷、芍藥苷通過(guò)抑制病理狀態(tài)下BBB 的通透性而發(fā)揮大腦保護(hù)作用[42-43]；二是中藥藥效物質(zhì)促進(jìn)BBB 通透性而增加藥物透過(guò)率，例如冰片、大麻二酚能夠開(kāi)放BBB，促進(jìn)其他藥物透過(guò)[44-45]。BBB模型在芳香開(kāi)竅藥的研究中應(yīng)用廣泛，這類中藥多數(shù)通過(guò)影響B(tài)BB 來(lái)發(fā)揮作用。王利蘋等[46]總結(jié)了冰片、麝香、安息香和石菖蒲等芳香開(kāi)竅藥對(duì)BBB的作用機(jī)制：這類中藥“芳香之性走竄”，首先本身易透過(guò)BBB；其次能夠“引藥上行”，促進(jìn)其他藥物透過(guò)BBB；再者能夠保護(hù)病理狀態(tài)下的BBB。有研究者通過(guò)單細(xì)胞培養(yǎng)BBB 模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葛根素與冰片合用時(shí)，冰片可使BBB 通透性增強(qiáng)，促進(jìn)葛根素進(jìn)入大腦[47]。湯丹丹等[48]采用共培養(yǎng)模型進(jìn)一步證明冰片能促進(jìn)葛根素入腦，發(fā)揮“引藥上行”的作用。

當(dāng)前的BBB 模型以細(xì)胞培養(yǎng)模型為主，在構(gòu)建模型時(shí)除了關(guān)注BBB 的結(jié)構(gòu)致密性之外，還要充分考慮藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體分布的特異性。中藥研究中大部分采用共培養(yǎng)模型，研究者不斷從培養(yǎng)條件、動(dòng)力學(xué)、模型材質(zhì)等方面加以改進(jìn)，以期更接近人體BBB。

3 體外代謝模型及其應(yīng)用

藥物經(jīng)吸收、分布后，進(jìn)入代謝器官被代謝。機(jī)體主要的代謝器官是肝臟，在胃腸道中也會(huì)發(fā)生代謝。體外肝代謝模型在中藥代謝研究中應(yīng)用廣泛，腸道菌代謝模型在揭示腸道菌、藥物、機(jī)體相互作用的研究中被日益重視，胃腸液代謝模型例如人工胃液和人工腸液模型，常用于研究藥物穩(wěn)定性及降解動(dòng)力學(xué)。

3.1 體外肝代謝模型及其應(yīng)用

肝臟內(nèi)的藥物代謝主要分為2 個(gè)階段：Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝[49]。Ⅰ相代謝主要是引入官能團(tuán)，脂溶性藥物經(jīng)氧化、還原、水解、水合等反應(yīng)生成極性基團(tuán)，其中涉及的酶主要為CYP 450 酶系。Ⅱ相代謝主要進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，化合物的極性基團(tuán)或由Ⅰ相代謝生成的極性基團(tuán)與內(nèi)源性極性小分子物質(zhì)結(jié)合，其中涉及的酶主要包括葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGT）、硫酸轉(zhuǎn)移酶（sulfate transferase，SULT）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）等。

3.1.1 常見(jiàn)的體外肝代謝模型

體外肝代謝模型分器官、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、代謝酶5 個(gè)層次，目前應(yīng)用較多的是肝細(xì)胞、肝微粒體、肝S9、肝組織胞質(zhì)溶膠、基因重組酶系等。其他肝代謝模型還包括精密肝切片（precision-cut liver slices，PCLS）、離體肝臟灌流等。

3.1.1.1 肝細(xì)胞模型 肝細(xì)胞模型包括原代肝細(xì)胞、培養(yǎng)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系模型。原代肝細(xì)胞應(yīng)用最早，以后又發(fā)展出培養(yǎng)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系。

原代肝細(xì)胞：來(lái)源于正常肝組織的培養(yǎng)物，在藥物研發(fā)領(lǐng)域具有獨(dú)特地位并且被廣泛應(yīng)用，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）譽(yù)為CYP450 酶誘導(dǎo)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[50]。相對(duì)于肝微粒體等亞細(xì)胞組分，原代肝細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜，保留了完整的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶系統(tǒng)、輔因子以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，在藥物代謝研究中表現(xiàn)出良好的體內(nèi)外相關(guān)性，是研究藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用最實(shí)用的模型之一。但是，原代肝細(xì)胞價(jià)格昂貴，在培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生表型改變，難以長(zhǎng)期保持其原有特性，而且人源肝細(xì)胞個(gè)體差異大、保存困難，凍融會(huì)降低肝細(xì)胞的活力和代謝功能，其貼壁能力也會(huì)受到影響[51]。Aghdai等[52]用冷凍保存技術(shù)對(duì)原代肝細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化，證明凍存時(shí)加入二硫蘇糖醇和果糖，能夠增加肝細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞活力和功能。通過(guò)對(duì)細(xì)胞處理?xiàng)l件如細(xì)胞凍存、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)加以改進(jìn)，原代肝細(xì)胞仍然是研究藥物體內(nèi)代謝的最佳體外模型[53]。

培養(yǎng)肝細(xì)胞：常用的肝細(xì)胞培養(yǎng)方法有凝膠包埋培養(yǎng)、聚球體培養(yǎng)以及2D 和3D 培養(yǎng)。肝細(xì)胞凝膠包埋培養(yǎng)和聚球體培養(yǎng)均屬于肝細(xì)胞組織化培養(yǎng)，兩者的肝細(xì)胞存活率及代謝酶活性均高于單層培養(yǎng)，而且聚球體培養(yǎng)高于凝膠包埋培養(yǎng)[54]。在體外藥物代謝及清除率研究中，2D 和3D 培養(yǎng)比常規(guī)培養(yǎng)更具優(yōu)勢(shì)。2D 培養(yǎng)是將肝細(xì)胞培養(yǎng)于一層固相細(xì)胞外基質(zhì)上，但肝細(xì)胞在堅(jiān)硬的固相物上培養(yǎng)容易導(dǎo)致肝功能快速喪失，而3D 培養(yǎng)則可以規(guī)避該缺點(diǎn)。3D 培養(yǎng)包括多細(xì)胞球培養(yǎng)、共培養(yǎng)、肝器官芯片等[55-56]。例如，HepatoPac 是一種人原代肝細(xì)胞和小鼠纖維母細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，可在7 d 內(nèi)保持肝細(xì)胞的代謝功能。Chan 等[57]采用該模型測(cè)定了17種成分的體內(nèi)清除率，證明該共培養(yǎng)模型可精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)某些藥物的體內(nèi)清除率。

永生化肝細(xì)胞：因其無(wú)限可培養(yǎng)性和表型穩(wěn)定性，永生化肝來(lái)源的細(xì)胞系已被建議作為原代肝細(xì)胞的理想替代模型。但是，永生化肝細(xì)胞與原代肝細(xì)胞的最大區(qū)別是表達(dá)的代謝酶活性較低[58]。人肝源性細(xì)胞系包括HepaRG、HepG2、HCC-T 和Hep3B 等。HepaRG 細(xì)胞是一種從人肝癌細(xì)胞獲取并建立的肝癌細(xì)胞系，用二甲基亞砜（DMSO）處理后可進(jìn)行分化，分化的HepaRG 細(xì)胞培養(yǎng)物通常是肝樣細(xì)胞（約50% ～ 55%）和膽管樣上皮細(xì)胞的混合物[59]。該細(xì)胞系中CYP450 酶表達(dá)水平和活性明顯弱于原代肝細(xì)胞，但是比HepG2 細(xì)胞更接近人肝細(xì)胞的水平，并且HepaRG 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性物質(zhì)的敏感性高于HepG2 細(xì)胞[60]。HepG2 細(xì)胞系最初來(lái)源于一例15 歲白種人的肝癌組織，其功能特性已被廣泛研究。該細(xì)胞系能夠模擬多種肝功能，如血漿蛋白的合成和分泌、膽固醇和三酰甘油代謝、脂蛋白代謝和運(yùn)輸、膽汁酸合成、糖原合成等。HepG2 細(xì)胞系的主要缺點(diǎn)是藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)有限，大多數(shù)藥物代謝CYP基因表達(dá)豐度較低，而且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后，該細(xì)胞系的蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生差異，不利于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重現(xiàn)[61]。

3.1.1.2 肝細(xì)胞亞組分模型 肝微粒體、肝S9、肝胞質(zhì)溶膠均屬于肝細(xì)胞亞組分，可通過(guò)差速離心法制備（見(jiàn)圖1）[62]。

肝微粒體：含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞細(xì)胞組分，包括CYP450 酶和少量Ⅱ相代謝酶。由于其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、易于貯存、重現(xiàn)性好，肝微粒體被廣泛用于藥物代謝及藥物相互作用研究。不同種屬來(lái)源的肝微粒體的代謝研究結(jié)果存在差異，人肝微粒體應(yīng)該是最理想的，但是其來(lái)源有限。劉文莉等[63]對(duì)香柑內(nèi)酯在7 種不同肝微粒體（人、恒河猴、食蟹猴、豚鼠、大鼠、小鼠、比格犬）中的代謝差異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該化合物在比格犬、大鼠、人肝微粒體中的代謝較為接近。一般認(rèn)為肝微粒體代謝中主要發(fā)生Ⅰ相代謝，Ⅱ相代謝產(chǎn)物很少，這與制備的肝微粒體的轉(zhuǎn)化效率有關(guān)。當(dāng)肝微粒體轉(zhuǎn)化效率足夠高時(shí)，Ⅱ相代謝產(chǎn)物也經(jīng)常被檢測(cè)到，肝微粒體制備前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的代謝酶誘導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還原型輔酶系統(tǒng)NADPH 的加入對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很大[64-65]。

肝S9：肝組織去除勻漿沉淀物后的混懸溶液，其主要特征是含有較多Ⅱ相代謝酶，擁有比較完整的代謝功能，提供的代謝輪廓比肝微粒體更全面。然而，肝S9 的代謝酶活性普遍較低，反應(yīng)體系靈敏度較差，部分代謝物無(wú)法檢測(cè)到[66]。肝S9 中膜蛋白（CYP、UGT 和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）濃度低于肝微粒體，但是其中的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的濃度高于肝微粒體[67]。筆者團(tuán)隊(duì)采用藜蘆酸葡萄糖酯作為底物對(duì)肝微粒體和肝S9 代謝進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)肝S9 模型對(duì)酯類的代謝能力高于肝微粒體模型[68]。

肝胞質(zhì)溶膠：肝細(xì)胞勻漿經(jīng)超速離心除去所有細(xì)胞器和顆粒后的上清液部分，主要含Ⅱ相代謝酶，Ⅰ相代謝酶較少。肝胞質(zhì)溶膠所含Ⅰ相代謝酶比肝微粒體少，但Ⅱ相代謝酶多于肝S9，通常應(yīng)用于單個(gè)可溶性酶活性、特定代謝途徑的研究。肝胞質(zhì)溶膠也可作為肝微粒體的輔助手段來(lái)確定藥物代謝途徑[69]。

圖1 差速離心法制備肝細(xì)胞亞組分示意圖Figure 1 Schematic diagram of hepatocyte subfractions prepared by differential centrifugation

3.1.1.3 基因重組酶系 基因重組酶系是指利用基因工程及細(xì)胞工程方法，將人源的CYP450 或UGT 基因轉(zhuǎn)染到大腸埃希菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)后產(chǎn)生的重組酶系。通過(guò)該酶系，能夠定性研究酶系中單個(gè)亞型對(duì)整個(gè)代謝反應(yīng)的相對(duì)貢獻(xiàn)和代謝途徑。基因重組CYP450 酶系與肝微粒體實(shí)驗(yàn)關(guān)聯(lián)性好，適合對(duì)藥物代謝進(jìn)行微觀化和細(xì)節(jié)化的研究[70]。但是，該酶系價(jià)格昂貴、成本高，與人體內(nèi)相同酶的豐度也有較大差異，且用重組酶得到的代謝結(jié)果，不能直接外推到人體代謝。

3.1.1.4 其他體外肝代謝模型 精密肝切片應(yīng)用于肝功能研究始于Krumdieck 切片機(jī)的引入[71]，之后van Midwoud 等[72]建立了精密肝切片實(shí)時(shí)高效液相色譜分析系統(tǒng)（on-line HPLC analysis system）。精密肝切片保留了大部分肝藥酶及細(xì)胞器，所有細(xì)胞類型均存在，并且有各種細(xì)胞類型之間的細(xì)胞通訊。但是肝切片活力維持時(shí)間僅為5 ～ 7 d，不適于長(zhǎng)周期的代謝研究，且切片技術(shù)有待進(jìn)一步提升。該技術(shù)現(xiàn)在已被用于藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物對(duì)酶的抑制或誘導(dǎo)、生物代謝速率動(dòng)力學(xué)等研究[73]，在肝毒性研究中也有報(bào)道，有研究者利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)何首烏細(xì)胞毒成分只有在高濃度時(shí)才有肝毒性[74]。離體肝臟灌流是將完整的肝臟置于體外，使用人工方法進(jìn)行灌注以保持肝臟的組織結(jié)構(gòu)和生理功能，在一定條件下離體肝臟與藥物互相接觸，確定藥物在肝臟中的變化。該模型在器官水平上研究藥物代謝，可以完整地揭示藥物在肝臟中的代謝通路，但是實(shí)際操作中需要一定的環(huán)境條件，操作復(fù)雜且受時(shí)間的限制[75]。

3.1.2 體外肝代謝模型在中藥研究中的應(yīng)用概況

體外肝代謝模型的每個(gè)層次各有其適用范圍，在中藥代謝研究中應(yīng)用較多的是亞細(xì)胞組分模型，例如肝微粒體和肝S9 模型，其中肝微粒體模型應(yīng)用最多。筆者團(tuán)隊(duì)利用肝微粒體模型研究了金蓮花中黃酮類和酚酸類化合物的肝代謝，發(fā)現(xiàn)這2 類成分既可發(fā)生羥基化、脫烷基等Ⅰ相代謝，又可發(fā)生糖基化、乙?；娶蛳啻x[65-66]。楊秀偉團(tuán)隊(duì)在中藥成分的肝微粒體代謝研究方面也做了大量工作，制備了一系列代謝產(chǎn)物并進(jìn)行了精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)解析[76-77]。汪祺等[78]采用肝微粒體模型研究了何首烏的肝毒性，闡明了大黃素、羥基大黃素等成分通過(guò)抑制UGT 1A1 而導(dǎo)致肝毒性的機(jī)制。鄭梅等[79]采用肝微粒體模型研究了六味地黃丸與硝苯地平的相互作用，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸與硝苯地平共孵育前后代謝指紋圖譜無(wú)明顯差異。

3.2 體外胃腸道代謝模型及其應(yīng)用

胃腸道特定的酸堿環(huán)境和其中容納的微生物所分泌的代謝酶對(duì)化學(xué)成分有修飾作用，藥物的胃腸道代謝越來(lái)越受到重視。

3.2.1 常用的體外胃腸道代謝模型

體外胃腸道代謝模型主要有腸道菌代謝模型、腸微粒體代謝模型和人工胃腸液模型。

3.2.1.1 腸道菌代謝模型 腸道菌群是人和動(dòng)物腸道內(nèi)普遍存在且構(gòu)成極為復(fù)雜的微生物群體，在腸道代謝過(guò)程中起重要作用[80]。腸道菌群含有豐富的代謝酶，可催化腸道內(nèi)化學(xué)成分發(fā)生如水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、含氧化合物向含氮化合物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、聚合反應(yīng)等各種反應(yīng)[81]。腸道菌群中絕大多數(shù)細(xì)菌為厭氧菌，需要嚴(yán)格的厭氧條件，對(duì)環(huán)境的酸堿度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求也比較苛刻。構(gòu)建與體內(nèi)真實(shí)情況最接近、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好的腸道菌培養(yǎng)模型是體外腸道菌代謝研究的關(guān)鍵。常見(jiàn)的腸道菌體外實(shí)驗(yàn)體系有分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)等。筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)腸道菌代謝的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)模型達(dá)到穩(wěn)態(tài)需要一個(gè)連續(xù)傳代過(guò)程，并且腸道菌對(duì)底物的代謝過(guò)程一般表現(xiàn)為啟動(dòng)、加速和完成3 個(gè)階段，這與其增殖曲線有關(guān)[82-83]。楊秀偉等[84]建立了人腸道菌代謝模型的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對(duì)培養(yǎng)基的配制、滅菌，人腸道混合菌株/菌叢的制備，菌株代謝活性篩選等實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。Molly 等[85]基于連續(xù)發(fā)酵模型建立了人腸道微生態(tài)模擬器，該系統(tǒng)由胃、小腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸5 個(gè)模擬反應(yīng)單元組成，研究者利用該反應(yīng)器研究了不同營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)腸道菌群的影響，通過(guò)測(cè)定菌群數(shù)量、酶活性等指標(biāo)，證明該模型與人體內(nèi)數(shù)據(jù)相吻合。隨后有學(xué)者設(shè)計(jì)了電腦控制發(fā)酵系統(tǒng)，通過(guò)電腦控制相互連接的單元，使代謝物能在單元間流動(dòng)[86]。

3.2.1.2 腸微粒體代謝模型 腸微粒體代謝模型是由腸微粒體與藥物在模擬人體生理?xiàng)l件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。腸微粒體可通過(guò)差速離心法制備，其CYP450 酶系統(tǒng)可催化多種藥物進(jìn)行氧化或還原反應(yīng)。該模型具有制備技術(shù)和操作簡(jiǎn)單、代謝反應(yīng)快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，不足之處在于缺乏膜轉(zhuǎn)運(yùn)體及部分酶系統(tǒng)[87]。有研究者采用肝、腸微粒體對(duì)玳玳果效應(yīng)組分新橙皮苷、柚皮苷進(jìn)行了代謝比較，發(fā)現(xiàn)肝是新橙皮苷、柚皮苷的主要代謝部位[88]。某些成分在腸吸收過(guò)程中確實(shí)會(huì)被腸黏膜細(xì)胞中的代謝酶代謝，例如槲皮素及其衍生物會(huì)被代謝成酚酸等[89]，但由于腸吸收的過(guò)程非常短暫，這方面的研究還沒(méi)有引起足夠重視。

3.2.1.3 人工胃腸液代謝模型 胃液中含有胃蛋白酶、黏液蛋白，腸液中含有胰蛋白酶、膽汁和腸系膜分泌液，這些物質(zhì)均可參與藥物代謝?？诜幬镌谖钢信c胃蛋白酶作用，蛋白質(zhì)被分解成小肽，苷類化合物被代謝為苷元，而酯類化合物可被腸液水解。人工胃腸液模型主要應(yīng)用于單體成分的胃腸液穩(wěn)定性研究[90-91]，基于藥物在胃腸液的穩(wěn)定性可進(jìn)一步開(kāi)展藥物劑型、質(zhì)量檢測(cè)等研究。根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，藥物成分在胃腸液中的變化不如預(yù)期明顯，這可能與這些成分在胃中停留時(shí)間短，腸液pH 比較溫和有關(guān)。

3.2.2 胃腸道代謝模型在中藥研究中的應(yīng)用概況

腸道菌群對(duì)中藥成分的代謝有助于其吸收，這方面的研究已成為中藥藥效物質(zhì)研究中不可忽視的環(huán)節(jié)。筆者團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了一系列研究來(lái)幫助明確中藥的藥效物質(zhì)[31,82,92-94]。然而，不同個(gè)體體內(nèi)的腸道菌群存在差異，由此導(dǎo)致中藥成分在不同個(gè)體體內(nèi)的代謝輪廓不同。例如某些能夠代謝碳苷類化合物的細(xì)菌只存在于特定的個(gè)體內(nèi)，導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)此類成分的生物利用度存在差異[95]。采用體外腸道菌代謝模型最好區(qū)分人種、年齡、性別、體質(zhì)、飲食習(xí)慣、生理和病理狀態(tài)等，需要在這些方面進(jìn)行深入研究。

近年來(lái)隨著腸道菌群研究的不斷升溫，腸道菌代謝模型已被用于腸道菌群結(jié)構(gòu)研究，與代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在中藥作用機(jī)制研究中取得了不少值得關(guān)注的結(jié)果。有報(bào)道稱，中藥可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮扶正祛邪作用，有助于腸道疾病、心血管疾病、肝臟疾病及神經(jīng)性疾病的防治[96]。倪雅麗[97]通過(guò)分析代謝組學(xué)及腸道微生物表達(dá)譜的差異，明確了益智仁對(duì)蛋白表達(dá)、代謝通路的影響，闡釋了益智仁治療糖尿病腎病的機(jī)制。劉永平等[98]對(duì)腎病綜合征患者腸道菌群進(jìn)行了宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)患者的腸道菌群物種多樣性顯著減少。對(duì)現(xiàn)有的腸道菌代謝模型加以改造，開(kāi)展中藥-腸道菌群-人體的相互作用研究可能是未來(lái)腸道菌群研究的一個(gè)熱點(diǎn)。另外，腸道菌群規(guī)模宏大，其自身代謝產(chǎn)物也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生影響[99]，這方面的研究也值得期待。

4 體外排泄模型及其應(yīng)用

藥物排泄是指藥物以原形或代謝物的形式，通過(guò)排泄器官排出體外的過(guò)程。藥物排泄的主要方式為腎臟排泄和膽汁排泄。極性相對(duì)較小、相對(duì)分子質(zhì)量小的藥物主要通過(guò)腎臟排泄，腎臟中的轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)許多內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的消除有很大貢獻(xiàn)[100]。極性大、相對(duì)分子質(zhì)量大的藥物主要通過(guò)膽汁排泄，膽汁排泄以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，一些中藥例如黃連、金銀花、生姜、甘草和赤芍等通過(guò)促進(jìn)膽汁分泌，起到利膽作用[101]。

4.1 常用的體外排泄模型

目前報(bào)道的體外藥物排泄模型較少，常用的有離體腎臟灌流（isolated perfused kidney，IPK）模型和肝細(xì)胞三明治培養(yǎng)（sandwich-cultured hepatocytes）模型。

4.1.1 離體腎臟灌流模型

IPK 是一種在不受血液循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)影響的條件下，特異性地對(duì)腎臟排泄進(jìn)行研究的技術(shù)。在建立之初，該模型用于腎臟的生理生化功能研究，經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于藥物的腎臟排泄、代謝、清除研究，也可用于研究藥物之間的相互作用和腎毒性[102]。IPK 的優(yōu)點(diǎn)在于可保留完整腎功能的前提下排除體內(nèi)復(fù)雜因素的干擾，并且可對(duì)灌注液蛋白濃度、pH 等多種因素進(jìn)行控制，能研究不同因素對(duì)腎臟功能的影響；其缺陷在于灌注液流速較高以及遠(yuǎn)端腎小管功能減弱等[103]。

4.1.2 肝細(xì)胞三明治培養(yǎng)模型

肝細(xì)胞三明治培養(yǎng)是將新鮮分離或冷凍保存的原代肝細(xì)胞接種于2 層基質(zhì)（下層為膠原，上層為人工基底膜）之間進(jìn)行培養(yǎng)[104]。三明治結(jié)構(gòu)培養(yǎng)肝細(xì)胞可以改善肝細(xì)胞的形態(tài)和生存能力，重建體外肝細(xì)胞極性，形成極性的基底膜和類膽小管結(jié)構(gòu)，分別介導(dǎo)細(xì)胞吸收和膽汁外排[105]。該模型是研究肝膽藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體功能及其調(diào)控的首選體外模型。沈國(guó)林等[106]采用該模型研究了P-gp 介導(dǎo)的洛哌丁胺膽汁排泄，發(fā)現(xiàn)洛哌丁胺與P-gp 抑制劑合用可顯著降低洛哌丁胺經(jīng)膽汁的排泄。

4.2 體外排泄模型在中藥研究中的應(yīng)用概況

當(dāng)前中藥成分的排泄研究還主要以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，通過(guò)收集動(dòng)物糞便、尿液或膽汁等方法進(jìn)行研究。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的影響因素較多，使中藥的排泄研究還相對(duì)不夠深入，特別是排泄機(jī)制的研究有待加強(qiáng)。采用體外模型進(jìn)行的相關(guān)研究較少，律廣富等[107]應(yīng)用離體腎臟灌流模型研究了玉米須總黃酮的利尿作用，證明玉米須總黃酮能促進(jìn)尿酸在腎臟中的排泄，改善尿酸對(duì)腎臟的損害。相信未來(lái)隨著上述模型的日益完善和新模型的不斷開(kāi)發(fā)，中藥成分的排泄研究水平會(huì)逐漸提升。

5 整體體外代謝模型及其應(yīng)用

藥物代謝是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過(guò)程，前述體外模型只能模擬某一階段或?qū)用娴拇x過(guò)程，在連貫性和整體性方面與體內(nèi)研究尚有差別?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了整體體外模型的建立，在近些年產(chǎn)生了一些前沿技術(shù)，如多“器官芯片”系統(tǒng)、微流控芯片技術(shù)等。

5.1 多“器官芯片”系統(tǒng)

多“器官芯片”系統(tǒng)也被稱為“詢問(wèn)器（interrogator）”，是將多個(gè)人體“器官芯片”集成至一個(gè)自動(dòng)化系統(tǒng)中，生成“器官芯片”平臺(tái)，用于體外藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究。首個(gè)“器官芯片”——肺芯片由Huh 等[108]建立，它是一種微流體培養(yǎng)裝置，由透明的柔性聚合物組成，其中包含2 個(gè)由多孔膜隔開(kāi)的平行中空通道，器官特異性細(xì)胞培養(yǎng)于其中一個(gè)通道的膜的單側(cè)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞在另一通道培養(yǎng)以重現(xiàn)血管，每個(gè)通道均灌注細(xì)胞類型特異性培養(yǎng)基。多孔膜允許2 個(gè)通道相互連通和進(jìn)行物質(zhì)交換，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、藥物以及由器官特異性代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等[109]。為了驗(yàn)證該系統(tǒng)是否能夠模擬人體環(huán)境，Herland 等[110]把人的腸道芯片、肝臟芯片和腎臟芯片連接起來(lái)，將尼古丁加入系統(tǒng)中模擬口服藥物的代謝過(guò)程。由系統(tǒng)得出的尼古丁到達(dá)不同組織通道所需的時(shí)間、各組織通道中最大尼古丁濃度，以及計(jì)算機(jī)模擬模型中的肝芯片清除率均與人體用藥之后的測(cè)量值非常接近。該研究者還使用肝臟芯片、腎臟芯片和骨髓芯片連接的“器官芯片”裝置對(duì)順鉑的藥效學(xué)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)順鉑的肝腎代謝及清除率與順鉑化療患者的相當(dāng)，而且腎臟芯片中的細(xì)胞表達(dá)了與化療期間人體腎臟相同的生物損傷標(biāo)記物，說(shuō)明多“器官芯片”系統(tǒng)能夠?qū)λ幬锏奈?、分布、代謝、排泄和毒性進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。

5.2 微流控芯片技術(shù)

Jie 等[111]自主研發(fā)了雙層微流控芯片，芯片上層蛇形中空纖維內(nèi)腔接種Caco-2 細(xì)胞，模擬腸道藥物吸收和運(yùn)輸行為；芯片下層接種HepG2 細(xì)胞，模擬肝臟進(jìn)行代謝相關(guān)研究。研究者以抗癌藥物染料木素和達(dá)卡巴嗪對(duì)該微流控芯片進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證，證明其可維持細(xì)胞的良好代謝能力，可作為有效的代謝模型用于藥物聯(lián)合機(jī)制研究。該技術(shù)可模擬腸肝行為，與質(zhì)譜聯(lián)用可分析組合藥物的吸收和代謝。Choucha-Snouber 等[112]建立了肝腎共培養(yǎng)微流體生物芯片模型，以HepG2/C3a 和HepaRG 細(xì)胞系模擬肝，以MDCK 細(xì)胞系模擬腎，并通過(guò)異環(huán)磷酰胺經(jīng)肝代謝產(chǎn)生腎毒性化合物的代謝過(guò)程證明了肝腎共培養(yǎng)模型的可用性。有研究者又進(jìn)一步建立了腸、肝、皮膚、腎4 種器官共培養(yǎng)芯片，通過(guò)對(duì)各個(gè)模擬器官的功能測(cè)定證明了該共培養(yǎng)芯片在28 d 內(nèi)具有穩(wěn)定的代謝能力[113]。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

經(jīng)歷數(shù)十年的發(fā)展，傳統(tǒng)的體外模型日益完備，在中藥代謝研究中發(fā)揮了積極作用。然而，大多數(shù)體外模型是在西藥的代謝研究中建立的，適用于單一或少數(shù)成分的代謝研究。中藥多以復(fù)方用藥，成分復(fù)雜，代謝產(chǎn)物多種多樣，還存在成分間的相互作用，這些均增加了研究難度，也對(duì)體外模型的構(gòu)建和改良提出了更高要求。第一，需要構(gòu)建和完善適合中藥特色的體外模型，適應(yīng)中藥成分體內(nèi)過(guò)程復(fù)雜的特點(diǎn)，例如引入放射性同位素示蹤技術(shù)等先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，達(dá)到高通量、高內(nèi)涵、精準(zhǔn)和實(shí)時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)。第二，現(xiàn)在的藥物代謝研究已不再單純是中藥成分的代謝產(chǎn)物研究，已經(jīng)擴(kuò)展到“組學(xué)”范疇，例如代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)，并且與機(jī)體的癥候/疾病相聯(lián)系誕生了方證代謝組學(xué)，如何建立模擬機(jī)體內(nèi)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的體外代謝模型，甚至是病理/癥候代謝模型，是對(duì)科研人員的考驗(yàn)。第三，中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)整體觀念，能精準(zhǔn)反映體內(nèi)過(guò)程的整體體外模型，例如上文提到的多“器官芯片”系統(tǒng)，微流控芯片技術(shù)等對(duì)于研究中藥代謝也必不可少。雖然體外藥代模型在中藥研究中的應(yīng)用尚需改進(jìn)，但是隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，其構(gòu)建會(huì)愈發(fā)完善，研究結(jié)果會(huì)越來(lái)越逼近人體內(nèi)的真實(shí)代謝輪廓，成為研究中藥代謝必不可少的手段。