謝小來，魏川子，馬逢春，陳明明，王 雪，孫悠然，焦培鑫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國玉米秸稈資源豐富，但秸稈利用率較低，處理不當(dāng)易造成環(huán)境污染。玉米秸稈作為牛羊等反芻動物普遍應(yīng)用的粗飼料，可提供大量粗飼料來源，但營養(yǎng)價值低、適口性差且消化率低。因此，探索安全、實(shí)用的玉米秸稈飼料加工調(diào)制技術(shù)，對我國環(huán)境保護(hù)和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

斯日古楞等將玉米秸稈中添加尿素，袋貯試驗(yàn)表明，隨尿素（1%、2%、3%、4%）添加量增加玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量逐漸提高，添加尿素4%使玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量提高到8.71%[1]。但采用尿素氨化玉米秸稈，氨揮發(fā)損失較多，污染環(huán)境。王雨瓊等選取側(cè)耳屬白腐菌，從營養(yǎng)價值和抗氧化性能角度研究白腐菌對玉米秸稈的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵物中干物質(zhì)體外消化率、粗蛋白質(zhì)含量、抗氧化性能顯著提高（P＜0.05）[2]。楊娟等利用解淀粉芽胞桿菌作發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株可提高秸稈飼料利用率[3]。生物法處理可提高玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量，改變營養(yǎng)組成，但耗費(fèi)時間長、發(fā)酵效率低、碳水化合物損失大。楊雪霞等對玉米秸稈作氨化汽爆處理，高溫下短時間氨化秸稈（8 min）與常溫氨化（30 d）相比，縮短氨化時間，氨化后秸稈中氮含量提高，處理后秸稈富集大量可發(fā)酵性碳源、氮源，將氨化汽爆后玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵，粗蛋白質(zhì)含量顯著提高，比直接發(fā)酵玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量提高1 倍[4]。氨化可增加秸稈中氮元素，為酵母菌生長提供氮源。酵母菌發(fā)酵時將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，酵母菌生長過程出現(xiàn)的各種酶和其他營養(yǎng)成分，可有效提高玉米秸稈消化率和營養(yǎng)價值[5]。通過酵母菌產(chǎn)出的單細(xì)胞蛋白質(zhì)品質(zhì)良好，營養(yǎng)豐富，尤其是選用產(chǎn)朊假絲酵母，獲得菌株的蛋白質(zhì)含量更高，可生產(chǎn)動物飼料[6]。本試驗(yàn)采用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自主研發(fā)的高壓密閉秸稈氨化系統(tǒng)處理玉米秸稈，制成進(jìn)一步發(fā)酵試驗(yàn)的氨化玉米秸稈原料。選擇產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵處理菌種，對氨化后玉米秸稈作微生物處理，探究氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量最適發(fā)酵條件，為提高玉米秸稈營養(yǎng)價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

原料：玉米秸稈（由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號2.1180）。

1.1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基：酵母膏0.3%，麥芽浸膏0.3%，蛋白陳0.5%，葡萄糖1%。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

超凈無菌操作臺、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、IS-RDV1 氣浴恒溫振蕩器、高壓滅菌鍋、冰箱、DZ-400/2S型真空包裝機(jī)、FOSS凱氏定氮儀。

1.2 玉米秸稈氨化處理

玉米秸稈經(jīng)自然風(fēng)干，粉碎過20 目篩后經(jīng)室溫密封保存。采用高壓密閉秸稈氨化系統(tǒng)，設(shè)置壓強(qiáng)0.3 MPa，對玉米秸稈作2 h氨化處理。

1.3 菌種活化

用1%葡萄糖、0.3%麥芽浸膏、0.3%酵母膏配制液體活化培養(yǎng)基，裝入錐形瓶高壓滅菌（121 ℃，15 min），滅菌后將液體培養(yǎng)基放入超凈無菌操作臺冷卻至室溫。將原種（斜面培養(yǎng)基保存的酵母菌）接種于液體培養(yǎng)基，氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h（28 ℃，150 r·min-1），為一級菌液；繼續(xù)采用液體活化培養(yǎng)基高壓滅菌冷卻至室溫，接種一級菌液，氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h（28 ℃，150 r·min-1），為二級菌液，制得酵母液體菌種為4.7×107cfu·mL-1，甘油封存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 氨化玉米秸稈發(fā)酵試驗(yàn)

1.4.1 氨化玉米秸稈發(fā)酵處理

將57 個15.5 cm×24 cm 發(fā)酵袋中分別裝入100 g 氨化玉米秸稈，用滅菌小噴瓶分別加入所需要酵母菌液和相應(yīng)水分含量，混勻后真空密封，分別放入相應(yīng)溫度隔水式恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵對應(yīng)天數(shù)后取出，烘箱65 ℃烘48 h，回潮24 h，保存待測。

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用4 個單因素（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、含水量、酵母菌接種量）多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究某一因素對氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響時，其他因素（參考條件：28 ℃、48 h、65%含水量、5%接種量）保持一致。溫度：24、28、32、36 ℃。時間：24、48、72、96、120 h。含水量：55%， 60%,65%, 70%, 75 %。接種量（%，V/W，V：菌液體積；W：氨化玉米秸稈重量）：1%,3%，5%，7%，9%。對照組為未發(fā)酵氨化玉米秸稈。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過溫度A、時間B、含水量C和酵母菌接種量D作四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Response surface test factor levels and coding

1.5 測定指標(biāo)及方法

粗蛋白質(zhì)（CP）測定，凱氏定氮法[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel 并利用SPSS 22 軟件作One-Way ANOVA 方差分析和Duncan's 多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05表示差異顯著。采用Design-Expert 軟件作響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度、時間、含水量、酵母菌接種量對氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.1.1 發(fā)酵溫度

由表2得出，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量隨著溫度升高呈先升后降趨勢。不同溫度處理組與對照組（編號5）之間差異均顯著（P＜0.05）。24 ℃組粗蛋白質(zhì)含量分別與28 ℃、32 ℃、36 ℃粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。28 ℃與36 ℃組粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。32 ℃組粗蛋白質(zhì)含量最高為16.17%，且32 ℃組粗蛋白質(zhì)含量分別與24 ℃、28 ℃、36 ℃粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。因此選擇32 ℃為較適宜溫度參數(shù)。

2.1.2 發(fā)酵時間

由表2得出，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量隨著時間增加呈先升后降趨勢，48 h 組粗蛋白質(zhì)含量最高為15.64%，72 h 略降低。處理組粗蛋白質(zhì)含量均高于對照組（編號11）（P＜0.05）。24 h組粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。48 h與96 h組粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05），且與120 h 組粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05），但48 h與72 h組差異不顯著（P＞0.05）。而72 h 組粗蛋白質(zhì)含量分別與24 h、96 h、120 h 組粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。因此選擇48 h 為發(fā)酵氨化玉米秸稈適宜時間參數(shù)。

表2 發(fā)酵溫度、時間、含水量、酵母菌接種量對氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 Effect of fermentation temperature,time,water content,and yeast inoculum on crude protein content of ammoniated corn stalks(DM basis)

2.1.3 發(fā)酵含水量

由表2得出，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量隨著水分含量增加呈先升后降趨勢，65%組粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高為15.89%。不同含水量處理組與對照組（編號17）之間差異均顯著（P＜0.05）。60%與75%組粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。65%組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于55%組、60%組、70%組、75%組（P＜0.05）。因此選擇含水量65%為發(fā)酵適宜參數(shù)。

2.1.4 酵母菌接種量

由表2得出，隨著酵母菌接種量增加發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量逐漸增加，接種量為9%時略降低。不同酵母菌含量處理組與對照組（編號23）之間均差異均顯著（P＜0.05）。1%組分別與3%、5%、9%粗蛋白質(zhì)含量差異均顯著（P＜0.05）。9%組分別與3%、5%粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。7%組分別與1%、3%、5%、9%組粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05），且接種量為7%時，粗蛋白質(zhì)含量最大為16.72%。因此選擇酵母菌接種量為7%為適宜參數(shù)。

2.2 響應(yīng)面分析與方差分析

通過單因素試驗(yàn)，得出發(fā)酵溫度28～36 ℃，發(fā)酵時間24～72 h，發(fā)酵時含水量60%～70%，發(fā)酵時酵母菌接種量5%～9%時，粗蛋白質(zhì)含量較高。為進(jìn)一步優(yōu)化酵母菌發(fā)酵氨化玉米秸稈工藝參數(shù)，以溫度、時間、含水量和酵母菌接種量為自變因素，以粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)一組四因素三水平含29個處理組的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)值見表3。

由表3 得出，第17 個處理組粗蛋白質(zhì)含量最高，即在發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵時含水量65%，酵母菌接種量7%條件下，發(fā)酵后氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量最高為17.01%。利用Design-Expert 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

其中，R 為粗蛋白質(zhì)含量，A、B、C 和D 分別對應(yīng)溫度、時間、含水量和酵母菌接種量編碼。

表3 發(fā)酵氨化玉米秸稈中粗蛋白質(zhì)含量響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface test results of crude protein content in fermented ammoniated corn stalks

方差分析結(jié)果及顯著性分析見表4，失擬項(xiàng)P=0.6833＞0.05，說明回歸方程擬合度較好。模型F=83.49，P＜0.0001差異極顯著，說明該模型顯著。模型R2=0.9882，擬合程度較高，可分析和預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。

由表4可知，溫度、時間、含水量和酵母菌接種量對粗蛋白質(zhì)含量影響均顯著（P＜0.05）。對于交互作用而言，AB、AD、BD、CD是顯著項(xiàng)。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Regression equation analysis of variance

3 討 論

3.1 發(fā)酵溫度、時間、含水量、酵母菌接種量對氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響

3.1.1 溫度因素

溫度過低抑制酵母菌生長和繁殖，從而影響發(fā)酵原料粗蛋白質(zhì)含量，因此適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)，提高溫度可增強(qiáng)酵母菌活性，利于發(fā)酵[8]。溫度過高，則抑制酵母菌活性，影響發(fā)酵原料粗蛋白質(zhì)終含量。鄧怡國等研究指出菠蘿葉渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣量在溫度25～35 ℃呈逐漸增加趨勢，35 ℃時產(chǎn)氣量最大，35 ℃上升至40 ℃時，產(chǎn)氣量隨溫度升高而下降[9]。尚紅巖研究結(jié)果表明酵母菌最高活性發(fā)酵溫度為30～32 ℃[10]。梁裕崴的A21酵母菌性能測試結(jié)果表明，該酵母在25～35 ℃時正常生長，最適發(fā)酵溫度為28～31 ℃[11]。發(fā)酵效果隨溫度升高呈先升后降趨勢，最適溫度時發(fā)酵效果最佳，與本試驗(yàn)研究一致。蘭曉勇等利用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵苦蕎，苦蕎總蛋白含量先降后升，24 ℃時達(dá)到最高[12]；球蛋白含量先增后降，28 ℃時球蛋白含量最高；醇蛋白含量先增后降，發(fā)酵溫度為30 ℃時，醇蛋白含量最高；清蛋白先降后增，32 ℃時最高；谷蛋白在發(fā)酵溫度24～32 ℃范圍內(nèi)，含量無明顯變化。發(fā)酵時不同蛋白質(zhì)含量隨溫度變化趨勢不同，不同蛋白質(zhì)含量最高發(fā)酵溫度不同。本文僅探討溫度對玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響，應(yīng)進(jìn)一步研究溫度對玉米秸稈中其他蛋白質(zhì)成分的影響。

3.1.2 時間因素

酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物和含量隨酵母菌生長階段而改變。一般情況下，發(fā)酵初期，隨發(fā)酵時間推移，酵母菌大量繁殖，粗蛋白質(zhì)含量顯著增加[13]。到達(dá)最適發(fā)酵時間，產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值且基本保持恒定。發(fā)酵時間過長，酵母菌進(jìn)入衰退期，逐漸自體溶解，產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量逐漸降低[14]。單立莉等研究不同發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的影響，48 h 時發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量最高[15]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。劉紀(jì)成等[16]采用多菌混合發(fā)酵方法處理花生秸稈，發(fā)酵時間分別為（3、5、10、15 d），以粗蛋白質(zhì)和纖維素酶活為考查指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 d 的發(fā)酵效果較好，粗蛋白質(zhì)含量為15.37%。這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，因其采用多菌混合發(fā)酵方法，時間設(shè)置不同，因此發(fā)酵時間存在差異。本試驗(yàn)考慮利用最少時間達(dá)到最優(yōu)處理效果，減少時間成本。提高氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量，選用多菌種代替單一產(chǎn)朊假絲酵母對其發(fā)酵處理有待研究。氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量提高程度和發(fā)酵菌種有關(guān)。

3.1.3 含水量因素

對固態(tài)發(fā)酵來說，水分含量是影響菌體蛋白增加的重要因素[17]。含水量過低時，不利于酵母菌細(xì)胞擴(kuò)散，抑制其生長；含水量過高，原料黏性增加，散熱差，不利于酵母菌生長[18]。當(dāng)含水量適宜時，原料顆粒之間疏松度適宜有利于排出微生物代謝產(chǎn)生CO2，促進(jìn)微生物菌體生長，且發(fā)酵料中氨態(tài)氮和蛋白質(zhì)產(chǎn)物在水中有一定溶解性，降低粗蛋白質(zhì)損失。劉強(qiáng)等試驗(yàn)中設(shè)置不同梯度含水量（15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 和50%），發(fā)現(xiàn)發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量隨水分梯度先升后降，40%時粗蛋白質(zhì)含量最高[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含水量為65%時發(fā)酵效果最好，可能因發(fā)酵原料差異和發(fā)酵過程所用菌株不同。劉曉明等以酵母菌、乳酸菌等分別固態(tài)發(fā)酵豆粕、玉米和棉籽粕，設(shè)置4個梯度含水量，結(jié)果表明不同菌株對不同發(fā)酵原料所需最適水分含量均不同[20]?；菸纳炔捎冒茬鹘湍妇l(fā)酵玉米秸稈，研究發(fā)現(xiàn)含水量對發(fā)酵效果有顯著影響，含水量低，發(fā)酵效果差，營養(yǎng)物質(zhì)含量變化小，含水量60%～70%時，酵母菌大量繁殖，粗蛋白質(zhì)含量較高，與未發(fā)酵玉米秸稈差異顯著[21]。本試驗(yàn)含水量65%時粗蛋白含量最高，與惠文森等研究結(jié)果一致，說明產(chǎn)阮假絲酵母發(fā)酵時最適含水量為65%。

3.1.4 酵母菌接種量因素

酵母菌接種量小，發(fā)酵周期延長，無法充分利用發(fā)酵飼料營養(yǎng)物質(zhì)。隨接種量增加，粗蛋白質(zhì)含量提高[22]。接種量過大時，酵母菌生長旺盛，酵母細(xì)胞數(shù)量較多，發(fā)酵速度過快，易造成溫度過高，不利于酵母繁殖，酵母菌自體溶解，粗蛋白質(zhì)含量略下降。Gibbons 等研究釀酒酵母接種量對飼料固相發(fā)酵的影響，接種量為5%時酵母菌生長繁殖較快且乙醇產(chǎn)量最多，接種量更高時反而無優(yōu)勢，低于5%時發(fā)酵時間延長且酵母菌數(shù)量較低[23]。祁宏山等研究混菌發(fā)酵玉米秸稈，8%為最佳接種量，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高[24]。孫先鋒等將獼猴桃破碎打漿，分別添加不同酵母菌含量（3%、5%、8%），均發(fā)酵3 d，發(fā)現(xiàn)添加5%酵母菌含量組酒精產(chǎn)量最高[25]。相同條件下，接種量增加使發(fā)酵產(chǎn)物在相同培養(yǎng)時間下菌群數(shù)更大，相同時間產(chǎn)酶量增加，但菌體過多會消耗大量蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)7%酵母菌接種量為最適接種量，差異原因可能與發(fā)酵菌株和發(fā)酵底物不同有關(guān)。

3.2 發(fā)酵對氨化玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響

采用高壓密閉秸稈氨化系統(tǒng)對玉米秸稈氨化后發(fā)酵，玉米秸稈氮含量大幅增加，富集大量可發(fā)酵碳源和氮源，有利于微生物發(fā)酵。微生物將纖維素、半纖維素降解并轉(zhuǎn)化為菌體蛋白。高壓條件下秸稈半纖維素發(fā)生水解，木質(zhì)素部分降解，有利于發(fā)酵時微生物合成菌體蛋白，提高發(fā)酵后產(chǎn)物粗蛋白含量。李日強(qiáng)等對玉米秸稈氨化處理后組合菌發(fā)酵，氨化后玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量為13.19%，發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量為17.64%[26]，與本試驗(yàn)一致。說明在氨化基礎(chǔ)上發(fā)酵可顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量。譚禮將已氨化、發(fā)酵處理粉狀秸稈飼喂健康白鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采食量和體重飼喂氨化發(fā)酵秸稈的白鼠均高于對照組白鼠，解剖試驗(yàn)白鼠未發(fā)現(xiàn)體表、臟器及呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)病理性改變[27]。因此，氨化后發(fā)酵玉米秸稈可顯著提高粗蛋白質(zhì)含量，飼喂動物安全可行。

4 結(jié) 論

a.產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵氨化玉米秸稈最適條件：溫度32 ℃，時間48 h，含水量65%，酵母菌接種量7%。

b. 通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化氨化玉米秸稈發(fā)酵參數(shù)。此條件下（溫度32 ℃，時間48 h，含水量65%，酵母菌接種量7%）氨化玉米秸稈發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量最高為17.01%。