朱秀清 ，王 嬋，孫禹凡，鐘明明，齊寶坤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，哈爾濱 150028）

人造食品通常以膠體形式存在，如乳液、泡沫、凝膠和分散體等。乳液是兩種不混溶液體混合物，一種分散于另一液體中[1]；可通過(guò)酸誘導(dǎo)、鹽誘導(dǎo)、熱誘導(dǎo)等方法使乳液形成一種軟固體材料，通常稱為乳液凝膠，包括傳統(tǒng)制造食品奶酪、酸奶、冰淇淋、甜點(diǎn)、涂抹醬和加工肉等[2]。乳液凝膠基于乳液遞送系統(tǒng)，調(diào)整凝膠組成、尺寸、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在食品界備受關(guān)注。

大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI）是重要植物蛋白產(chǎn)品，具有重要營(yíng)養(yǎng)作用和功能特性，應(yīng)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，單一SPI在功能上無(wú)法滿足食品加工需要，油脂、蛋白質(zhì)、糖為重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，影響食品穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)，通過(guò)向SPI 中添加某種特殊成分可改善SPI特殊功能。

多糖與蛋白結(jié)合可提高食品乳液及凝膠穩(wěn)定性，中性及陰性多糖穩(wěn)定效果優(yōu)于陽(yáng)性多糖[4]，本文選用陰性和中性多糖與SPI 相互作用。研究復(fù)合物形成乳液及乳液凝膠穩(wěn)定性。瓜爾豆膠是中性多糖，在食品工業(yè)中發(fā)揮穩(wěn)定劑和增稠劑作用，與蛋白可通過(guò)氫鍵作用相互結(jié)合。Santos 等利用馬鈴薯蛋白為原料，瓜爾豆膠為穩(wěn)定劑，制備瓜爾豆膠-馬鈴薯蛋白乳液，發(fā)現(xiàn)乳液穩(wěn)定性提高[5]?？ɡz是陰離子多糖，廣泛應(yīng)用于食品中，可作為增稠劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑及脂肪替代品等[6]。

近年蛋白-多糖復(fù)合物研究廣泛，其中瓜爾豆膠和卡拉膠研究較多，但比較兩種多糖對(duì)SPI乳液及乳液凝膠穩(wěn)定性的影響研究甚少。本文比較兩種多糖對(duì)SPI 乳液穩(wěn)定性的影響，通過(guò)CaCl2誘導(dǎo)形成乳液凝膠，觀察多糖種類及濃度對(duì)乳液凝膠基本性質(zhì)影響，為制備具有高穩(wěn)定性遞送系統(tǒng)及低脂肪軟固體食品替代物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜爾豆膠，購(gòu)自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；卡拉膠，購(gòu)自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；亞麻籽油，購(gòu)自北京金世倉(cāng)糧油貿(mào)易有限公司；CaCl2，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；磷酸氫二鈉，購(gòu)自北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉，購(gòu)自北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX UTL 2000 高壓均質(zhì)機(jī)，購(gòu)自上海標(biāo)本模型有限公司；LGR20-W 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自北京京立離心機(jī)有限公司；Mastersizer 2000 激光粒度儀，購(gòu)自英國(guó)馬爾文儀器有限公司；購(gòu)自UV-5100 型高性能紫外可見分光光度計(jì)， 購(gòu)自上海奧析科學(xué)儀器；MAGNA-IR 560傅里葉變換紅外光譜儀，購(gòu)自美國(guó)NICOLET 儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI提取

通過(guò)堿溶酸沉方法提取大豆分離蛋白[7]。將大豆磨粉后過(guò)80 目篩，將所得豆粉與正己烷以料液比1：3（m/V）比例混合，常溫下攪拌1 h 脫脂3 次，將脫脂豆粉按料液比為1：10（m/V）加入去離子水，1 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)豆粉溶液pH 為8.5，以9 000 g 離心30 min 去除其中不溶性物質(zhì)。取上清液用2 mol·L-1HCl溶液調(diào)pH為4.5，再9 000 g離心30 min，蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)而凝聚沉淀。取離心沉淀物，加5倍去離子水，調(diào)節(jié)pH為7.0，水洗離心（9 000 g、30 min）2 次，棄上清液，將沉淀物冷凍干燥得到SPI。

1.3.2 SPI-多糖乳液制備

將適量SPI分散在磷酸鹽緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.0）中，室溫下攪拌2 h 以確保蛋白質(zhì)完全溶解。將SPI（最終濃度為5%，W/V）溶液分別加入卡拉膠、瓜爾豆膠（最終濃度為0、0.05%、0.1%、0.2%和0.3%，W/V）溶液中，邊滴邊利用磁力攪拌，形成復(fù)合物攪拌30 min后，加入10%（V/V）亞麻籽油，1 100 r·min-1條件下均質(zhì)3 min，80 MPa下高壓均質(zhì)，制備不同乳液，4 ℃條件貯藏。

1.3.3 SPI-多糖乳液凝膠制備

在1.3.1基礎(chǔ)上，向乳液中加入1 mol·L-1CaCl2分散液，使CaCl2濃度達(dá)到35 mmol·L-1，攪拌均勻后將其放入60 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后即于冰水浴中冷卻至室溫，將新鮮制備乳液凝膠4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 動(dòng)態(tài)光散射

應(yīng)用Mastersizer 2000 儀器測(cè)量蛋白質(zhì)顆粒尺寸分布（d4,3）和ζ-電位。根據(jù)Khales 等[8]方法略有改動(dòng)。將制備不同帶電荷多糖乳液分散到0.02 mol·L-1，pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，樣品稀釋至0.1 wt%，在室溫下測(cè)量3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。分散體（SPI）使用1.450 折射率，連續(xù)相使用1.331折射率[9]。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)

采用激光共聚焦（CLSM）觀察乳液微觀結(jié)構(gòu)，采用Okuro[10]方法略有改動(dòng)。分別稱取一定量尼羅藍(lán)和尼羅紅溶于異丙醇中，充分溶解最終濃度分別為1%和0.1%，將制備尼羅紅和尼羅藍(lán)過(guò)濾膜，過(guò)去殘?jiān)?zhǔn)確吸取上述制備新鮮乳液200 μL，稀釋5 倍，加入25 μL 尼羅藍(lán)和20 μL 尼羅紅，充分混勻，30 min 后制片，全程避光。樣品染色以后，置于表面皿上，放置在激光共聚焦顯微鏡后，采用10倍目鏡和60倍物鏡，552和488 nm波長(zhǎng)下與相應(yīng)燃料對(duì)應(yīng)，觀察拍照。

1.3.6 乳化活性、乳化穩(wěn)定性

根據(jù)Zhang 等[11]方法略改動(dòng)，測(cè)定乳化活性（Emulsion activity index， EAI）及 乳 化 穩(wěn) 定 性（Emulsion stability index，ESI）取上述1.3.2 新鮮制備乳狀液40 μL，8 mL 0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液稀釋40 倍，漩渦振蕩器使其充分混勻。以0.1%SDS 為空白，使用紫外分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值，記為A0；靜置30 min 后再次在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值，記為A30乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）測(cè)量公式如下：

式中，EAI為單位質(zhì)量乳液乳化表面積（m2·g-1）；N為稀釋倍數(shù)（200）；C 為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g·mL-1）；φ為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)0.1；A0為0 min時(shí)吸光值；A30為30 min時(shí)吸光值。

1.3.7 紅外光譜（FTIR）分析

采用程志先和Bekale等[12]方法稍作修改。將多糖與SPI復(fù)合物直接冷凍干燥，冷凍干燥后樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片測(cè)定紅外光譜。為減少水蒸汽影響干擾，用干燥N2持續(xù)注入測(cè)量室。測(cè)定時(shí)波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1，得到紅外吸收曲線采用Peak fitting 軟件和高斯曲線擬合，分析蛋白在不同多糖添加量下二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化。

1.3.8 凝膠作用力分析

根據(jù)Tang等[13]方法，略有改動(dòng)，分析添加不同多糖處理后形成SPI-多糖乳液凝膠作用力。配置4種緩沖溶液分別為：A（離子水）；B（pH 8.0 Tris-Gly 緩沖液）；C（B+2% SDS）；D（C+1%β-ME）；稱取2 g 乳液凝膠樣品分別置于30 mL 上述4種緩沖溶液中，4 ℃環(huán)境下攪拌1 h，將分散液在4 800 g離心力下離心15 min，取上層乳狀液經(jīng)相應(yīng)緩沖液稀釋，600 nm 下測(cè)量吸光值，計(jì)算濁度值。乳液濁度值計(jì)算公式：

式中，T 為每cm 濁度；A 為600 nm 下吸光度；D是稀釋倍數(shù)；L是容器路徑長(zhǎng)度（cm）。

1.3.9 質(zhì)構(gòu)

按照Z(yǔ)hao 等[14]描述方法并在此基礎(chǔ)上略有改動(dòng)，將1.3.3 所制備乳液凝膠在4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏過(guò)夜，取出放在室溫（25 ℃）下平衡至少30 min，利用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定SPI乳狀液凝膠硬度、彈性等。探頭為P/0.5，側(cè)前速度5 mm·s-1，測(cè)定速度1 mm·s-1，測(cè)后速度5 mm·s-1，觸發(fā)力為5 g，測(cè)定距離為凝膠高度1/2。

1.3.10 持水性

乳液凝膠持水性測(cè)定根據(jù)Boutin等[15]方法適當(dāng)修改。取上述制備乳液凝膠樣品約20 g，放置于50 mL 離心管中，在4 ℃、10 000 g 條件下離心15 min，離心后將離心管倒置30 min，使析出水分充分釋放，用濾紙小心將釋放水分析出后稱量。持水率為離心后凝膠中水分含量與離心前總水分含量百分比，計(jì)算公式如下：

式中，WHC：持水率；W1：離心析出水后凝膠與離心管總重量；W2：離心前凝膠樣品與離心管總重量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3 個(gè)平行樣平均值，采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件處理，ANOVA分析數(shù)據(jù)差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)態(tài)光散射

不同多糖種類及濃度經(jīng)相同均質(zhì)壓力與SPI相互作用形成乳液平均粒徑d4,3變化趨勢(shì)如表1所示，未添加多糖形成乳液d4,3值一般分布在300 nm，而添加多糖乳液隨多糖類型及添加量不同，d4,3均呈增大趨勢(shì)，電位絕對(duì)值不同。當(dāng)多糖添加量較小（≤0.1%）時(shí)，在相同多糖添加量下，乳液d4,3表現(xiàn)為陰離子多糖乳液＜中性多糖乳液，即SPI-卡拉膠乳液＜SPI-瓜爾豆膠乳液，在多糖添加量為0.1%時(shí)，形成穩(wěn)定復(fù)合物，d4,3增加量相對(duì)于其他增加量較小，電位絕對(duì)值最大，證明在多糖添加量為0.1%時(shí)形成乳液最穩(wěn)定，優(yōu)于空白組。當(dāng)多糖添加量較高（＞0.1%）時(shí)，在相同多糖添加量下乳液d4,3表現(xiàn)為SPI-卡拉膠乳液＜SPI-瓜爾豆膠乳液，電位絕對(duì)值隨多糖濃度添加降低。由于卡拉膠是陰離子多糖，加入帶負(fù)電荷SPI 乳狀液中二者相互排斥，導(dǎo)致電位絕對(duì)值明顯降低，d4,3略增加；瓜爾豆膠是中性多糖，加入帶負(fù)電荷SPI乳液中二者通過(guò)氫鍵及疏水相互作用結(jié)合，電位絕對(duì)值無(wú)明顯變化，d4,3增加；當(dāng)添加多糖濃度比較高時(shí)，溶液粘度比較大，流動(dòng)性較差，形成乳狀液具有更大粒徑。結(jié)果表明，當(dāng)添加多糖濃度為0.1%時(shí)，乳液可達(dá)最穩(wěn)定狀態(tài)，陰離子多糖-卡拉膠形成乳液穩(wěn)定性優(yōu)于中性多糖-瓜爾豆膠所形成乳液。

表1 不同多糖及添加量下乳液動(dòng)態(tài)光散射Table 1 Dynamic light scattering of emulsions with different addition rates of different polysaccharides and polysaccharide

2.2 乳液微觀結(jié)構(gòu)分析

不同類型多糖及不同多糖添加量下形成乳液微觀結(jié)構(gòu)見圖1?？梢?，當(dāng)卡拉膠濃度較低（≤0.1%）時(shí)，乳液分散狀態(tài)較好，粒徑較小較均勻；在卡拉膠添加量為0.1%時(shí)，乳液穩(wěn)定性最佳，由于陰離子多糖可通過(guò)靜電相互作用與SPI形成使系統(tǒng)和乳液更穩(wěn)定。由圖1 可知，當(dāng)濃度超過(guò)0.2%、0.3%時(shí)粒徑明顯變大，與前文粒徑電位結(jié)果一致。瓜爾豆膠在不同濃度下形成的乳液，多糖添加量為0.1%時(shí)粒徑最小，濃度超過(guò)0.1%時(shí)，粒徑明顯變大。結(jié)果表明，多糖添加量為0.1%時(shí)，形成乳液相對(duì)較穩(wěn)定，卡拉膠穩(wěn)定乳液優(yōu)于瓜爾豆膠穩(wěn)定乳液。

2.3 乳化性分析

由圖2 可知，兩種多糖可改善乳液乳化特性。陰離子多糖卡拉膠-SPI 形成乳液，隨卡拉膠添加量增加EAI、ESI 呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)，在添加量為0.1%時(shí)達(dá)最高，這是因?yàn)樵谥行詶l件下，卡拉膠與SPI 帶正電荷部分結(jié)合形成SPI-卡拉膠復(fù)合物，吸附于界面，提高乳化性，一定濃度卡拉膠可增加體系黏稠度、增大界面膜厚度，防止乳粒聚集沉淀，提高其穩(wěn)定性，而卡拉膠添加量達(dá)0.2%、0.3%時(shí)，EAI、ESI 明顯下降說(shuō)明卡拉膠濃度過(guò)高不利于乳液穩(wěn)定性，這是由于多糖與蛋白質(zhì)在界面上競(jìng)爭(zhēng)吸附作用較強(qiáng)，使界面蛋白吸附量減小，乳化性降低。中性多糖瓜爾豆膠-SPI 所形成乳液，隨瓜爾豆膠添加量增加EAI 呈先升后降趨勢(shì)，ESI呈先降后升趨勢(shì)。在添加量為0.1%時(shí)EAI達(dá)最大，因?yàn)殡S多糖添加量變化可改變SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，改善蛋白質(zhì)乳化性，這與粒徑電位結(jié)論一致。

2.4 紅外光譜（FTIR）分析

通過(guò)紅外光譜表征不同多糖種類及添加量穩(wěn)定蛋白乳液中SPI 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化，利用Peak Fit擬合軟件分析計(jì)算圖譜（見圖3），得到不同多糖與SPI 形成乳液中SPI 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化如表2 所示。結(jié)果表明，相比未添加多糖SPI乳液，添加多糖后乳液中SPI β-折疊含量均增加，當(dāng)多糖添加量較低（≤0.1%）時(shí)，β-折疊呈增加趨勢(shì)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲呈減少趨勢(shì)；多糖添加量超過(guò)0.1%時(shí)，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲含量均降低，α-螺旋含量升高，說(shuō)明多糖添加改變SPI中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，與對(duì)乳液穩(wěn)定性與蛋白結(jié)構(gòu)改變關(guān)系預(yù)測(cè)結(jié)論一致。卡拉膠與瓜爾豆膠添加量為0.1%時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)含量最高，高達(dá)56.1%和45.0%，其他含量變化不明顯，因此推測(cè)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)改變可增加柔性結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子由無(wú)序變?yōu)橛行颍淖僑PI基本性質(zhì)，提高乳化性及穩(wěn)定性。

表2 不同多糖乳液中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure of proteins in different polysaccharide emulsions (%)

2.5 凝膠作用力分析

由圖4可見，不同種類乳液凝膠在B中溶解度比A 中溶解度高，而瓜爾豆膠-SPI 乳液凝膠溶解度比卡拉膠-SPI 乳液凝膠溶解小，但高于對(duì)照組。各樣品在C中溶解度高于B，說(shuō)明疏水相互作用在維持凝膠結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用；而添加多糖樣品在C和B中溶解度差值略大于空白組樣品，說(shuō)明添加多糖促進(jìn)SPI 乳液在形成凝膠過(guò)程中疏水鍵生成，各樣品在D中溶解度高于C，說(shuō)明二硫鍵在凝膠結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。乳液凝膠在各緩沖溶液中溶解度差值證實(shí)多糖加入增強(qiáng)各種作用力，增加凝膠強(qiáng)度。

2.6 質(zhì)構(gòu)

不同多糖及多糖添加量對(duì)CaCl2誘導(dǎo)SPI乳液凝膠硬度及黏彈性的影響見表3。

表3 不同多糖及多糖添加量下乳液凝膠質(zhì)構(gòu)Table 3 Texture of emulsion gels with different polysaccharides and polysaccharides added

由表3可知，卡拉膠、瓜爾豆膠兩種多糖形成乳液凝膠硬度及黏彈性均差異明顯，由于多糖添加量不同所形成乳液凝膠表現(xiàn)不同質(zhì)地特性，表明多糖濃度及類型對(duì)乳液凝膠影響較大。多糖添加量增加形成乳液凝膠黏度逐漸增大，瓜爾豆膠-SPI乳液凝膠更明顯；當(dāng)多糖添加量0～0.1%時(shí)，制備乳液凝膠硬度和彈性呈增加趨勢(shì)，0.2%～0.3%在中性條件下，卡拉膠與SPI呈相互排斥狀態(tài)時(shí)，由于體系排阻作用使卡拉膠對(duì)大豆分離蛋白凝膠增效，加入卡拉膠固定大量水分，增濃大豆蛋白，促進(jìn)凝膠形成，提高凝膠強(qiáng)度[3]，瓜爾豆膠可通過(guò)增加體系黏度發(fā)揮增稠作用提高凝膠硬度及彈性，但多糖超過(guò)某一濃度，因排斥作用而產(chǎn)生絮凝，導(dǎo)致凝膠硬度及彈性逐漸降低。Tang 等研究證明凝膠微觀結(jié)構(gòu)影響凝膠硬度，當(dāng)多糖添加量為0.1%時(shí)，凝膠具有最高硬度及彈性，可形成更聚集凝膠網(wǎng)絡(luò)，而多糖添加量超過(guò)0.1%時(shí)硬度及彈性呈相反趨勢(shì)[16]。因此，當(dāng)多糖添加量為0.1%時(shí)乳液凝膠硬度及彈性具有最優(yōu)表現(xiàn)，陰離子多糖卡拉膠形成乳液凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)更佳。

2.7 持水率

不同多糖及多糖添加量對(duì)CaCl2誘導(dǎo)SPI 乳液凝膠持水率影響見圖5。當(dāng)多糖添加量0～0.1%時(shí)，乳液凝膠WHC隨多糖添加量增加而增加，多糖添加量0.1%時(shí)持水率達(dá)最高，這是因?yàn)槎嗵桥cSPI產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，混合乳液凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此截留水量大；多糖添加量為0.1%～0.3%時(shí)，隨多糖添加量增加，形成乳液凝膠WHC降低，因?yàn)殡S多糖含量增加降低混合凝膠強(qiáng)度，大分子熱力學(xué)活性和凝膠網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)對(duì)WHC影響較大，高濃度生物聚合物非相容性誘導(dǎo)形成更多孔網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)毛細(xì)管力具有較低持水能力，因此增加脫水能力，導(dǎo)致滲出網(wǎng)絡(luò)水分增加，此結(jié)論與Kuhun等[17]及任菲[18]研究結(jié)果相似。通過(guò)以上分析得出結(jié)論，當(dāng)多糖添加量為0.1%時(shí)所形成乳液凝膠持水率最高，陰離子多糖作為穩(wěn)定劑優(yōu)于中性多糖。

3 結(jié) 論

當(dāng)多糖添加量為0.1%時(shí)所形成SPI-多糖復(fù)合物乳液粒徑分布均勻穩(wěn)定，乳滴形狀規(guī)則，表現(xiàn)較好乳化活性和乳化穩(wěn)定性，形成乳液凝膠硬度、彈性及持水能力顯著（P＜0.05）增加。多糖添加改變SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高乳化能力添加多糖為卡拉膠時(shí)SPI中β-折疊結(jié)構(gòu)含量最高，影響蛋白質(zhì)構(gòu)象柔韌性，增加乳液穩(wěn)定性；當(dāng)多糖添加量超過(guò)或低于0.1%時(shí)對(duì)乳液穩(wěn)定性及形成乳液凝膠宏觀結(jié)果造成不利影響。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖添加量為0.1%時(shí)，形成乳液最穩(wěn)定最好，凝膠硬度、粘彈性及持水能力最高，陰離子多糖優(yōu)于中性多糖。