呂以東 ，李瑩 ，張彥武 ，牛耀東 ,嚴文君 ，王璐 ，馮愛強

（1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州450052；2.鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科分子遺傳實驗室，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性中最為常見的惡性腫瘤,有極高的發(fā)病率，且其病死率僅次于肺癌[1]。三陰性乳腺癌是一種特殊亞型的乳腺癌,其癌組織免疫組化檢測雌激素受體、孕激素受體和原癌基因Her-2均為陰性，是一種侵襲性惡性腫瘤，轉移幾率較其他類型乳腺癌高[2]?，F代流行病學顯示三陰性乳腺癌預后較差，死亡風險很高，因此探索有效的分子靶基因對三陰性乳腺癌早期診斷和治療有十分重大的意義[3]。G蛋白信號轉導調控因子20（RGS20）是GTP酶激活因子，參與G蛋白偶聯受體蛋白信號轉導途徑，調節(jié)細胞功能活動，但RGS20對三陰性乳腺癌預后的研究較少,本研究旨在通過分析RGS 20表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征和生存情況的關系,擬尋求三陰性乳腺癌潛在的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月-2015年6月入院治療三陰性乳腺癌的患者82例臨床資料，年齡33~67 歲，平均（52.67±9.21）歲，均為女性，腫瘤>5cm 13例，≤5cm 69例,浸潤性導管癌37例、浸潤性小葉癌6例、其他浸潤性39例，淋巴結轉移33例、無轉移49例，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期58例、Ⅲ-Ⅳ期24例。采集患者乳腺癌組織和相應癌旁組織（癌距<3cm）,所有患者乳腺癌組織病理檢測確診為三陰性乳腺癌（ER陰性，PR陰性，HER-2陰性）[4]，排除其他惡性腫瘤，首次就診，術前均為接受其他放化療,無重要器官疾病，患者簽署知情同意書，本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 qRT-PCR檢測患者乳腺癌組織和癌旁正常組織中RGS20 mRNA的表達 取適量組織樣品于1mL Trizol裂解液中勻漿,充分裂解15min,于-80℃保存?zhèn)溆?。采用氯?異丙醇體系提取總RNA，參照逆轉率試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。按照SYBR PremixEX Taq試劑盒說明書進行qRT-PCR擴增,檢測樣品組織中GADPH、RGS20 mRNA的表達,程序設置參數為：95℃ 5min，94℃10s，65℃ 50s，70℃ 2min，38 個循環(huán)。 以 GADPH mRNA的表達量為內參,計算RGS20 mRNA的相對表達量，獨立重復3次以上，引物序列[5]見表1。

1.3 免疫組化檢測三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中RGS20的表達 取出組織標本烤蠟處理1h，二甲苯溶液脫蠟后酒精梯度水化，滴加3%過氧化氫溶液滅活，25℃孵育15min,置于枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復，加熱狀態(tài)孵育10min，滴加RGS20一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，37℃孵育 30min，滴加DAB工作液避光孵育4min，蘇木素復染10s，酒精梯度脫水后滴加二甲苯至透明，封片；于顯微鏡下隨機選取5個視野觀察。

RGS20陽性染色定位于胞漿,著色程度評分規(guī)則：棕褐色計3分，棕黃色計2分，淺黃色計1分，未著色計0分；著色細胞比例評分規(guī)則：大于75%計 4分，51%~74%計3分，26%~50%計2分，6%~25%計1分，小于5%計0分，最終得分為著色程度評分與著色細胞比例評分乘積，0~12分，其中0~4分評定為陰性表達，5~12分為陽性表達。以上評分過程由3位病理科高級醫(yī)師獨立進行，最終以均值作為結果。

1.4 病例隨訪 隨訪截止至2018年6月30日，確保每位患者隨訪時間達到36個月,隨訪形式為：復診、上門、電話等。術后1年內,1次/月；術后第2年,1次/季；術后第3年，1次/半年。隨訪內容為：了解患者無疾病生存期 (Disease Free Survival，DFS)、總生存期（Overall Survival，OS）和死亡原因。 DFS指患者首次治療到有疾病復發(fā)或疾病致死的時間間隔，OS指患者首次治療到任何原因致死的時間間隔,隨訪截止日期仍存活的患者以截止時間生存情況為準。

1.5 統(tǒng)計學方法 本研究數據采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間采用卡方（χ2）檢驗；等級資料行秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法分析生存率,生存期限比較采用Lo g-rank χ2法檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 基因GADPH和RGS20的引物序列

2 結果

2.1 患者組織中RGS20mRNA的表達 如圖1所示,三陰性乳腺癌患者癌組織中RGS20mRNA的表達 顯著高于癌旁組織（P<0.05）。

2.2 患者組織中RGS20的表達 RGS20在三陰性乳腺癌細胞中定位于胞漿,顯微鏡下表現為胞漿呈黃棕色或黃褐色，如圖2。三陰性乳腺癌患者癌旁組織中RGS20的陽性表達率為15.85%（13/81）；而乳腺癌組織中為68.29%（56/81），顯著高于癌旁組織（P<0.05），見表 2。

圖1 患者組織中RGS20mRNA的表達

圖2 RGS20在三陰性乳腺癌細胞中陽性染色定位（免疫組化×400）

表2 患者組織中RGS20的表達

2.3 患者癌組織中RGS20表達與臨床特征的關系三陰性乳腺癌患者不同淋巴結的轉移情況、臨床分期及Ki67百分比等臨床病理特征中RGS20的表達表現出顯著性差異（P<0.05），而不同年齡、腫瘤大小以及病理分類患者中RGS20的表達無明顯差異（P>0.05），見表 3。

表3 患者癌組織中RGS20表達與臨床特征的關系

2.4 患者癌組織中RGS20表達與生存情況的關系如圖3，Kaplan-Meier曲線顯示陽性表達RGS20的三陰性乳腺癌患者3年DFS為42.86%，3年OS為55.36%；陰性表達RGS20患者3年DFS為65.39%，3年OS為80.77%。陽性表達pS6K1患者3年DFS和OS均顯著低于陰性表達患者 （Logrank χ2=3.904、4.957，P=0.048、0.026）。

圖3 患者癌組織中RGS20表達與生存情況的關系

3 討論

三陰性乳腺癌病情發(fā)展較快,腫瘤負荷大且復發(fā)早轉移高，嚴重威脅到女性生命健康[6]。其發(fā)病機制尚不明確,研究表明三陰性乳腺癌多發(fā)于絕經前年輕女性,目前并沒有針對三陰性乳腺癌的治療指南，主要以化療為主，化療治療三陰性乳腺癌有效率很高，但是化療藥物選擇性差，容易產生不良反應，且預后差[7]。隨著對癌癥的深入研究，新型輔助化療藥物紫杉類、鉑類等對三陰性乳腺癌有一定的療效，但只有部分患者較敏感，能夠起到療效且有良好的預后[8,9]，故尋求出三陰性乳腺癌的腫瘤標記物對于三陰性乳腺癌的診斷和治療有著極其重要的意義。G蛋白偶聯受體家族是一種細胞表面受體，參與細胞增殖、存活、運動等過程，并與腫瘤的生長、血管的生存和轉移有關[10]。G蛋白信號調節(jié)蛋白是Gα亞基GTP酶活性增敏劑,可以放大GTP酶活性,是G蛋白偶聯受體蛋白信號轉導途徑中重要因子[11]。G蛋白偶聯受體蛋白信號轉導途徑主要有：⑴受體-G蛋白-Ac途徑,參與細胞分泌，肌細胞收縮,細胞通透性調節(jié)及胞內各種酶促反應；⑵受體-G蛋白-PLC途徑，參與調節(jié)細胞一系列生物效應[12,13]。G蛋白信號調節(jié)蛋白在多種癌細胞中有不同程度的表達,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，據報道RGS20基因低表達的Luminal型乳腺癌患者預后較好[14]，但RGS20的表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征及生存時間的研究較少。

本研究通過qRT-PCR法和免疫組化法檢測到三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中RGS20的表達顯著高于癌旁正常組織,表明RGS20的表達能反映出腫瘤的進展，可為腫瘤的早期治療提供指導。Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原,參與細胞有絲分裂過程,研究顯示浸潤型乳腺癌中Ki67與癌細胞增殖和侵襲轉移密切相關,常作為腫瘤細胞增殖標記物[15,16]。通過分析三陰性乳腺癌患者臨床病理特征與RGS20表達的關系，發(fā)現有淋巴轉移、Ki67百分比＞14%及臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者RGS20陽性表達分別顯著高于無淋巴轉移、Ki67百分比≤14%及臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者,揭示RGS 20高表達可能會提高癌細胞增殖能力和運動能力；而不同年齡、腫瘤大小和病理類型患者中RGS20陽性表達無顯著差異，揭示RGS20可能是一種新型的腫瘤靶點。隨訪36個月發(fā)現，陽性表達RGS20的三陰性乳腺癌患者3年DFS為42.86%，3年OS為55.36%；而陰性表達RGS20患者3年DFS為65.39%，3年OS為80.77%，表明RGS20陽性表達的三陰性乳腺癌患者生存時間更短，預后較差。

綜上所述，RGS20與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,揭示RGS20可作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤標記物,有助于三陰性乳腺癌的早期診斷和預后評估,為進一步研究三陰性乳腺癌發(fā)病機制提供新的研究方向。后續(xù)還可繼續(xù)探討RGS20在其他類型乳腺癌中的表達情況及與臨床預后的關系。