王 慧，陳 雄，林衛(wèi)潮，李曜靈，代 俊

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

在自然環(huán)境或工業(yè)環(huán)境中，微生物經常會面臨各種脅迫，包括外界環(huán)境中的脅迫因素和微生物自身代謝過程中產生的代謝物對細胞的脅迫作用[1]。自然界中廣泛存在Na＋，高鹽脅迫無論在食品還是在自然環(huán)境中都廣泛存在[2]。

酵母耐鹽性即酵母對高Na＋濃度溶液的適應能力，是某些工業(yè)酵母所必需的特性之一[3]。溶液中的高濃度Na＋會降低水分活度，限制酵母在自然和工業(yè)環(huán)境中的生長，并影響酵母的代謝水平。在高鹽環(huán)境中，維持胞內相對低的Na＋濃度與細胞膜的流動性息息相關[4]。質膜中固醇的比例、組成和結構是影響脂質膜和脂筏流動性的主要因素，固醇類型和含量的調控具有關鍵的生理調節(jié)作用[5]，這對許多細胞活動（包括細胞分選、細胞骨架組織和交配）都很重要[6-7]。

研究表明，麥角固醇是酵母膜脂中的重要組分，主要合成途徑如圖1所示，而C-5固醇去飽和酶ERG3為合成過程中最關鍵的酶之一，對麥角固醇形成至關重要[8]。本實驗通過構建敲除ERG3的菌株研究酵母固醇變化對其耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

野生釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeBY4741（MATahis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0），保藏于本實驗室；工程菌株Bs-1采用Cre-loxP系統(tǒng)[9-10]通過同源重組方法敲除ERG3基因構建[11]；過表達菌株Bs-2通過質粒pYES2游離表達BY4741的ERG3基因構建[12]；Escherichia coliDH5α用于構建游離表達質粒。質粒pUG6、pSH47、pYES2均用于本研究菌株構建。

氨芐青霉素、卡那霉素、遺傳霉素G418 廣州賽國生物科技有限公司；PC11-2×Pfu聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；HindIII 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；D-半乳糖 上海麥克林生化科技有限公司；5-氟乳清酸 BBI生命科學有限公司；膽固醇（色譜級） 上海源葉生物科技有限公司；酵母DNA提取試劑盒 廣州捷倍斯生物科技有限公司；質粒DNA小量試劑盒、PCR清潔試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 康寧生命科學（吳江）有限公司；一步法快速克隆試劑盒上海翊圣生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

酵母菌株耐鹽性驗證采用酵母浸出粉胨半乳糖（yeast extract peptone galactose，YPG）誘導培養(yǎng)基（20 g/L半乳糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、相應含量NaCl、20 g/L瓊脂）；酵母菌株活化采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）；鹽脅迫采用60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、60 g/L NaCl）用于搖瓶發(fā)酵；大腸桿菌質粒擴增采用LB培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，NaOH調pH值至7.0），根據(jù)對應質粒加入相應抗生素；酵母質粒篩選采用尿嘧啶省卻培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L不含氨基酸的細菌用酵母氮堿、2 g/L省卻尿嘧啶混合物（微量的各種氨基酸混合物））；酵母質粒pSH47丟失篩選采用5-氟-乳清酸篩選培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L不含氨基酸的細菌用酵母氮堿、2 g/L省卻尿嘧啶的混合物（微量的各種氨基酸混合物）、50 μg/mL尿嘧啶、1 g/L 5-FOA、20 g/L瓊脂）。

1.2 儀器與設備

圖 1 麥角固醇合成步驟Fig. 1 Synthetic pathway of ergosterol

WFJ2000型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；7890B型氣相色譜 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；YXQ-LS-100S II型高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司；5810R型高速冷凍離心機、PCR儀德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；SBA-90型生物分析傳感儀 山東省科學院生物研究所；氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 敲除菌株Bs-1的構建

ERG3敲除所用引物見表1，由上海生物工程有限公司合成，構建ERG3基因敲除盒步驟如下：1）以S. cerevisiaeBY4741的DNA為模板，以ERG3-UF和ERG3-UR為引物進行PCR擴增構建上游同源臂，以ERG3-DF和ERG3-DR為引物進行PCR擴增構建下游同源臂；2）以質粒pUG6的DNA為模板，以kanMX-f和kanMX-r為引物進行PCR擴增，獲得PCR產物loxP-kanMX-loxP；3）以ERG3-UF和ERG3-DR為引物，以上述3 種PCR產物為模板，通過融合PCR構建ERG3基因敲除盒[9-10]。

表 1 本實驗所用引物Table 1 Sequences of primers used in this experiment

利用LiAc轉化法[13-14]將獲得的ERG3基因敲除盒轉化到S. cerevisiaeBY4741感受態(tài)細胞中，涂布含100 μg/mL G418的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑選單菌落轉移到含100 μg/mL G418的液體YPD中，30 ℃培養(yǎng)2 d進行菌落PCR，擴增結果送南京金唯智公司測序驗證，獲得轉化成功的重組菌株（ERG3::kanMX）。

為防止kanMX篩選標記表達對菌株的代謝產生影響，構建菌株時將kanMX篩選標記刪除。將本實驗室保藏的pSH47質粒[15]用LiAc轉化法轉化到重組菌株（ERG3::kanMX）感受態(tài)細胞中，利用尿嘧啶省卻平板篩選陽性克隆子。陽性菌落利用YPG培養(yǎng)基誘導pSH47質粒中的Cre酶表達，刪除kanMX抗性篩選標記。再利用5-氟-乳清酸平板，篩選pSH47質粒丟失重組菌株[16]。通過尿嘧啶省卻液體培養(yǎng)基驗證pSH47質粒丟失成功。

1.3.2 過表達菌株Bs-2的構建

將本實驗室保藏的pYES2質粒[12]用HindIII酶切線性化；用表1中pYES2 UF和pYES2 UR為引物，以S. cerevisiaeBY4741的DNA為模板，采用PCR擴增ERG3基因。用一步法快速克隆試劑盒將線性化的pYES2質粒DNA和ERG3基因連接，構建重組質粒pYES2-ERG3[17]。利用LiAc轉化法將重組質粒轉化到S. cerevisiaeBY4741感受態(tài)細胞。同樣利用尿嘧啶省卻液體培養(yǎng)基篩選轉化成功的過表達菌株。

1.3.3 菌株的耐鹽性驗證

BY4741、Bs-1、Bs-2活化菌液按10%接種量接種到5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)至OD600nm均為3.0。再將每種菌株的菌液用無菌水稀釋成4 個梯度，即稀釋10、50、250、1 250 倍。將每種菌株的每個梯度菌液取0.8 μL點在YPG平板上，于28 ℃培養(yǎng)，每天觀察它們的生長狀態(tài)并拍照。所有實驗重復至少3 次，并顯示代表性結果。

1.3.4 菌株生理特性的測定

BY4741和Bs-1接種于YPD、60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)。菌液樣品于5 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液和菌體保存于-20 ℃，用于生理特性測定。

菌體烘干12 h計數(shù)菌體干質量濃度，菌體干質量濃度/（g/L）=菌體干質量/菌液體積。OD600nm用可見光分光光度計檢測[2]。葡萄糖含量用二硝基水楊酸法測定[18]。乙醇含量用生物傳感儀測定[19]。乙酸用氣相色譜測定，檢測條件為：安捷倫7890B，火焰離子化檢測器；Agilent HP-5毛細管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；程序升溫條件：40 ℃保留時間5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min升到220 ℃，220 ℃保留時間6 min；分流比10∶1，分流流量50 mL/min，進樣口溫度250 ℃，檢測器280 ℃，進樣體積1 μL。甘油濃度用甘油試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）測定，比甘油產率/（mmol/g）=甘油濃度/菌體干質量濃度。

1.3.5 固醇分析

將BY4741、Bs-1、Bs-2菌株接種到YPD、60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。將菌液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用去離子水水洗2 次，于液氮罐中速凍，再置于-80 ℃冰箱冰凍24 h，于冷凍干燥機中制成凍干菌粉。稱取20 mg凍干菌粉，加入7 mL溶劑（甲醇-異丙醇1∶1）、50 μg色譜級膽固醇內標和0.5 μm的玻璃珠渦旋破碎10 min，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，將上清液轉到旋轉蒸發(fā)儀中，轉速100 r/min、40 ℃水浴蒸發(fā)約2 min，濃縮為約1 mL的溶液，0.2 μm的有機濾膜過濾，進樣到GC-MS檢測。

GC-MS檢測條件：7890/5977 GC-MS系統(tǒng)；HP-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：GC-爐溫度以5 ℃/min從180 ℃（2 min）至300 ℃（4 min）；載氣流速1 mL/ min，進樣量1 μL，界面溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子碰撞電離70 eV，全掃描范圍m/z30～550，溶劑延遲3.5 min[20]。目標化合物的峰識別基于國家標準和技術研究所（NIST 14）數(shù)據(jù)庫。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

搖瓶實驗做3 次重復，并計算標準偏差，用Origin 9.0軟件作圖。固醇含量和比甘油產率進行3 次測定，運用GraphPad Prism 5.0軟件進行計算。

2 結果與分析

2.1 工程菌株的獲得

2.1.1kanMX同源敲除ERG3基因

利用引物對ERG3-UF和ERG3-DR，分別以野生型S. cerevisiaeBY4741 DNA和重組菌株（ERG3::kanMX）DNA為模板進行PCR擴增。如圖2所示，野生型菌株的擴增產物為2 497 bp，重組菌株（ERG3::kanMX）的擴增產物為2 960 bp。

圖 2 kanMX敲除菌株的PCR驗證Fig. 2 PCR validation of knockout strain with kanMX markers

2.1.2kanMX篩選標記的刪除

圖 3 刪除kanMX標記的敲除菌株的PCR驗證Fig. 3 PCR validation of knockout strain with kanMX markers being deleted

以Bs-1菌株的DNA為模板，以引物對ERG3-UF和ERG3-DR進行PCR擴增。Bs-1的擴增產物為1 500 bp（圖3）。

2.1.3 過表達菌株的驗證

利用一步法克隆試劑盒將ERG3和pYES2質粒連接成重組質粒，轉化到野生型S. cerevisiaeBY4741中，構建過表達菌株Bs-2。從構建成功的過表達菌株中，提取pYES2質粒DNA，用HindⅢ酶切驗證，得到2 個條帶，分別為1 097 bp的ERG3基因條帶和5 900 bp的線性化pYES2質粒DNA條帶（圖4）。

圖 4 過表達菌株的PCR驗證Fig. 4 PCR validation of overexpressing strains

2.2 菌株的耐鹽性平板驗證

如圖5a所示，在YPG平板上，3 個菌株的生長狀態(tài)良好且各稀釋梯度的菌落大小基本相同。在60 g/L NaCl-YPG培養(yǎng)基中，BY4741、Bs-2均生長良好，但Bs-1的生長狀態(tài)較差且隨稀釋梯度菌落生長不明顯；在80 g/L NaCl-YPG培養(yǎng)基中，BY4741和Bs-2均能生長，但Bs-1基本不生長，在高稀釋倍數(shù)下幾乎觀察不到菌落。由此可見，Bs-1的耐鹽性與野生菌株BY4741相比，耐鹽性能明顯下降。Bs-2與野生菌株BY4741相比，在所有鹽質量濃度條件下生長狀態(tài)基本一致。

圖 5 構建菌株的進一步驗證Fig. 5 Further verification of the constructed strain

2.3 固醇分析

用GC-MS測定各菌株中固醇含量，如圖5b所示，從這些菌株中主要檢測出了兩種固醇麥角固醇和5,6-二氫麥角固醇。Bs-1中沒有產生麥角固醇，卻產生了新固醇5,6-二氫麥角固醇，結構如圖5c所示。上述結果主要因為ERG3是麥角固醇合成過程中關鍵的去飽和酶，ERG3基因的敲除導致麥角固醇的前體物質糞固醇的C-5和C-6不能脫氫形成雙鍵，只能生成中間物5,6-二氫麥角固醇。在60 g/L NaCl-YPD下，Bs-1菌株合成5,6-二氫麥角固醇的量為（6.30±0.40）μg/mg，略高于無脅迫條件下（5.89±0.04）μg/mg。BY4741在YPD和60 g/L NaCl-YPD中，產生的麥角固醇量相當，為（3.50±0.50）μg/mg（圖5b）。Bs-2菌株在YPD下，產生的麥角固醇量為（3.30±0.10）μg/mg，和BY4741相當。工程菌株Bs-1敲除了ERG3基因，不能合成麥角固醇，其耐鹽性明顯下降。由此可見，酵母的耐鹽特性可能主要與固醇種類相關。

2.4 菌株的生理特性

由于工程菌Bs-2與BY4741在耐鹽性方面的表現(xiàn)相似，所以后期只取BY4741和耐鹽能力減弱的工程菌Bs-1在YPD和60 g/L NaCl-YPD中搖瓶發(fā)酵，檢測其代謝特性。如圖6所示，BY4741在YPD中的最大OD600nm為13.90±0.02，在60 g/L NaCl-YPD中的最大OD600nm為10.19±0.13，它在無脅迫條件下的最大OD600nm是鹽脅迫條件下的1.36 倍，表明鹽脅迫會使菌株的生長能力變弱，菌株需要消耗自身生長的部分能量用于對抗鹽脅迫。在60 g/L NaCl-YPD和YPD條件下，BY4741的乙醇產量都隨生長曲線的趨勢而增加，至穩(wěn)定期不再增加，保持穩(wěn)定。但BY4741在YPD中的乙醇最高產量為（10.75±0.25）g/L，在60 g/L NaCl-YPD中的乙醇最高產量為（6.50±0.00）g/L，它在無脅迫下的最高乙醇產量是鹽脅迫條件的1.65 倍。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741的乙酸產量與糖耗趨勢保持一致，葡萄糖7 h耗完，乙酸產量也在第7小時不再下降，保持穩(wěn)定。在60 g/L NaCl-YPD條件下，BY4741 13 h葡萄糖基本耗完，耗時比在YPD中多1 倍，而乙酸產量保持在0.48～0.75 g/L范圍內波動。在鹽脅迫下，BY4741的生長明顯變緩慢，糖耗減慢，生長周期延長，乙醇產量降低，生長受到抑制。

圖 6 BY4741在YPD（A）和60 g/L NaCl-YPD（B）培養(yǎng)基中生理特性Fig. 6 Physiological characteristics of BY4741 when cultured in YPD (A) and YPD (B) with 60 g/L NaCl

Bs-1菌株在YPD培養(yǎng)基中的最大OD600nm為11.4±0.14，在60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基中的最大OD600nm為5.56±0.30，它在無脅迫條件下的最大OD600nm是鹽脅迫的2.06 倍。進一步證明，Bs-1比BY4741的耐鹽性能差，并且應對鹽脅迫的滯后期更長。Bs-1在有或無鹽脅迫條件下，乙醇產生的趨勢也與生長趨勢一致。Bs-1在YPD中的最高乙醇產量為（5.90±0.10）g/L，在60 g/L NaCl-YPD中的最高乙醇產量為（4.20±0.00）g/L，Bs-1在無鹽脅迫下的最高乙醇產量均低于鹽脅迫下BY4741的最高乙醇產量，表明ERG3的敲除對釀酒酵母的乙醇產量也有一定的影響。在無脅迫條件下，Bs-1的乙酸產量與糖耗趨勢一致。在鹽脅迫條件下，Bs-1的乙酸產量在0.52～0.77 g/L范圍內波動，沒有明顯的增加或減少趨勢，如圖7所示。Bs-1在YPD中的生長狀態(tài)相比于BY4741有所減弱，乙醇產量明顯降低；Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中的生長狀態(tài)更差，相比于YPD中，生物量降低一半，乙醇產量進一步降低。

野生菌株BY4741和工程菌株Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中時，生長均受到抑制。在60 g/L NaCl-YPD中，BY4741的最大OD600nm為10.19±0.13，Bs-1的最大OD600nm為5.56±0.30，BY4741的最大OD600nm是Bs-1的1.83 倍；BY4741的最高乙醇產量為（6.50±0.00）g/L，Bs-1的最高乙醇產量為（4.20±0.00）g/L，BY4741的最高乙醇產量是Bs-1的1.55 倍；BY4741的乙酸產量保持在0.48～0.75 g/L范圍內，Bs-1的乙酸產量在0.52～0.77 g/L范圍內。

圖 7 Bs-1在YPD（A）和60 g/L NaCl-YPD（B）培養(yǎng)基中的生理特性Fig. 7 Physiological characteristics of Bs-1 when cultured in YPD (A) and YPD (B) with 60 g/L NaCl

2.5 甘油的積累和保留

甘油是酵母應對鹽脅迫產生的主要的滲透調節(jié)物，它能保持胞內水平衡、穩(wěn)定酶系統(tǒng)正常代謝功能以及恢復正常細胞容積。Herrera等[21]研究發(fā)現(xiàn)漢遜酵母主要通過產生甘油作為滲透調節(jié)物和將Na＋隔離在液泡中兩種策略應對鹽脅迫。在鹽脅迫下，為確保高濃度的胞內滲透調節(jié)物，酵母細胞會采取調整細胞周期，限制氧化還原元素和能耗的方式實現(xiàn)。測定酵母在YPD和60 g/L NaCl-YPD中胞內外比甘油產率（圖8）。在YPD中，BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞內比甘油產率分別為（0.015 4±0.000 1）mmol/g和（0.007 0±0.000 8）mmol/g；BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞外比甘油產率分別為（0.110 0±0.002 0）mmol/g和（0.064 0±0.002 0）mmol/g。在YPD中，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞內比甘油產率分別為（0.008 0±0.001 8）mmol/g和（0.011 8±0.000 1）mmol/g；Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞外比甘油產率分別為（1.260 0±0.060 0）mmol/g和（1.250 0±0.010 0）mmol/g。在無鹽脅迫條件下，BY4741和Bs-1產生的胞外比甘油產率均高于胞內比甘油產率，因此釀酒酵母對甘油的保留能力較差，大部分甘油都被外排到培養(yǎng)基中。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741產生的總比甘油產率在指數(shù)期約為0.125 0 mmol/g，穩(wěn)定期約為0.071 0 mmol/g；Bs-1產生的總比甘油產率在指數(shù)期約為1.268 0 mmol/g，穩(wěn)定期約為1.260 0 mmol/g。由此可見，Bs-1在無鹽脅迫條件下產生的甘油量比BY4741高。

在60 g/L NaCl-YPD中，BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期的胞內比甘油產率分別為（0.228 0±0.009 0）mmol/g和（0.165 0±0.005 0）mmol/g；BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞外比甘油產率分別為（8.900 0±1.100 0）mmol/g和（6.750 0±0.250 0）mmol/g。在60 g/L NaCl-YPD中，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞內比甘油產率分別為（0.200 0±0.040 0）mmol/g和（0.076 0±0.010 0）mmol/g；Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產生的胞外比甘油產率分別為（24.500 0±3.500 0）mmol/g和（13.100 0±0.100 0）mmol/g。在鹽脅迫下，BY4741和Bs-1產生比YPD中更多的甘油響應鹽脅迫；在指數(shù)期和穩(wěn)定期，Bs-1產生的總比甘油產率比BY4741更多，但大部分為胞外，胞內甘油濃度低于BY4741。

圖 8 菌株胞內外比甘油產率Fig. 8 Ratio between intracellular and intracellular glycerol production

3 討 論

本研究主要探索酵母麥角固醇與其耐鹽性之間的關系，構建了2 個工程菌株Bs-1（敲除菌株）和Bs-2（過表達菌株）。測定菌株的固醇種類和含量，發(fā)現(xiàn)Bs-2和BY4741的固醇種類和含量相近，Bs-1不能合成麥角固醇，卻合成了新固醇5,6-二氫麥角固醇。前期研究普遍認為麥角固醇合成最后幾步反應為圖1所示的線性過程[22]，近年來也有證據(jù)表明其中某些反應可能不是嚴格線性進行的[5,23]。因此，構建的ERG3缺失突變株Bs-1通常會被認為積累上位固醇或其“上游”產物糞固醇，并阻斷“下游”酶ERG5和ERG4的功能[24]。但實際結果卻是ERG3的敲除并沒有影響酶ERG5和ERG4的活性，最后生成并積累了新的產物5,6-二氫麥角固醇。這可能是因為相關酶的底物特異性相對較弱，導致麥角固醇最后幾步合成具有了很高的靈活性。

對3 個菌株（BY4741、Bs-1、Bs-2）的耐鹽性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)Bs-1的耐鹽性明顯變差。研究表明細胞膜中固醇的比例、種類、結構都會影響細胞膜的流動性[25]，敲除菌株Bs-1細胞膜中固醇種類發(fā)生了變化，導致細胞膜流動性的改變，影響菌株對鹽脅迫的耐受性。

酵母鹽脅迫適應性與細胞代謝過程密切關聯(lián)，其中氧化還原平衡是關鍵因素之一。在鹽脅迫條件下，胞外滲透壓的升高會引起S. cerevisiae胞質中NADH含量增加，乙醇減少，乙醛增加，導致酵母通過HOG途徑提高甘油生成量[26-27]。測定BY4741和Bs-1菌株在YPD和60 g/L NaCl-YPD中的生理性狀，發(fā)現(xiàn)60 g/L的NaCl對BY4741和Bs-1的生長都造成了影響，但Bs-1受到的脅迫影響最大。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741的生長狀態(tài)優(yōu)于Bs-1，菌體干質量濃度、乙醇產量都比Bs-1高，糖耗數(shù)率也較快。BY4741在60 g/L NaCl-YPD中的生長狀態(tài)與Bs-1在YPD培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)相似。Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中的生長嚴重受到脅迫，生物量、乙醇產量都較低。鹽脅迫條件下，BY4741和Bs-1乙酸含量無明顯變化。進一步測定BY4741和Bs-1在YPD和60 g/L NaCl-YPD中指數(shù)期和穩(wěn)定期胞內外比甘油產率，發(fā)現(xiàn)在YPD中，BY4741和Bs-1產生的比甘油產率不高，大部分甘油被外排到培養(yǎng)基中，甘油保留能力差。在鹽脅迫下，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期都比BY4741產生更多的甘油，并將大部分甘油排出胞外，導致BY4741的胞內比甘油產率高于Bs-1，這可能是BY4741比Bs-1更耐鹽的原因。甘油的保留能幫助細胞在面對鹽脅迫時阻止胞內水分外流，但甘油是一種脂溶性物質，它有透過脂膜的趨勢，能通過被動擴散穿過生物膜，所以保留甘油是一種生物調節(jié)過程。細胞膜的流動性是影響甘油保留的重要因素之一，而構成細胞膜組成成分和比例又決定了膜的流動性[28]，ERG3基因的敲除使細胞膜的主要固醇種類由麥角固醇轉變?yōu)?,6-二氫麥角固醇，這種改變增加了膜的流動性，使甘油通透性增強，Bs-1雖在鹽脅迫條件下合成了大量的甘油，但胞外甘油量比野生菌株BY4741多。此外，通過特定的轉運蛋白運輸甘油進入細胞是甘油保留另外一種途徑。主要分為兩種形式：低親和性轉運系統(tǒng)（協(xié)助運輸）和高親和性質子同向轉運系統(tǒng)（主動運輸），但它們的活性常會被高濃度鹽抑制[29-30]。因此，菌株Bs-1在鹽脅迫條件下雖然產生了大量甘油，但對甘油的保留能力減弱，導致細胞耐鹽能力降低。

4 結 論

本實驗通過構建釀酒酵母麥角固醇C-5去飽和酶ERG3的基因缺失突變株、耐鹽性平板驗證、固醇分析、生理特性測定，結果發(fā)現(xiàn)，突變株的鹽脅迫抗性減弱，不能合成麥角固醇，而合成了5,6-二氫麥角固醇，且鹽脅迫條件下甘油合成總量增加，胞內甘油含量降低，乙醇合成減少，乙酸合成增多，滯后期延長，生長狀態(tài)減弱。綜上所述，ERG3的敲除導致菌株質膜的固醇組成改變，影響包括甘油保留在內的一系列菌株表型特征，致使菌株鹽脅迫抗性減弱。由此可見，C-5去飽和酶ERG3與酵母細胞膜固醇組分和菌株耐鹽性息息相關，證明了固醇在酵母細胞應對鹽脅迫環(huán)境中所起的重要作用，并為工程化固醇組分提高工業(yè)酵母菌株魯棒性提供了理論支持。