梁秀美，張維一，張 微，謝拾冰，何如意，徐 靜，蘇來金，孫博倫，張 井,

（1.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，溫州市特色食品資源工程技術(shù)研究中心，浙江 溫州 325006；2.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 舟山 316000；3.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315000）

水果農(nóng)藥殘留量作為重要安全指標(biāo)，直接關(guān)系到食品安全問題。GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對水果等農(nóng)產(chǎn)品提出了更嚴(yán)格的殘留限量要求。因此，農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的新時代對水果中農(nóng)藥殘留的檢測工作也越來越重視[1]。農(nóng)藥殘留分析是一項對復(fù)雜混合物中痕量組分進行分析的技術(shù)，它通常包括樣品前處理和檢測兩部分。目前常見的樣品前處理新技術(shù)有加速溶劑萃取法[2-3]、微波萃取法[2,4]、固相微萃取[2,5-6]、分子印跡萃取技術(shù)[2,7-9]、QuEChERS法[2,10-13,14-18]等。水果中常用的分析技術(shù)有高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12,14,18-20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15,21-23]。多數(shù)有機氯、有機磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥揮發(fā)性強，容易加熱氣化，因此用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能取得較好的分析效果。但氨基甲酸酯類、苯甲酰脲類以及一些苯并咪唑類農(nóng)藥極性強、熱穩(wěn)定性差，加熱易分解，使液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法成為首選的分析方法。由于液相色譜-質(zhì)譜法能同時進行定性和定量分析，因此多用于農(nóng)藥殘留分析中。根據(jù)浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險管控（一品一策）2016—2018年的數(shù)據(jù)，楊梅整個生產(chǎn)過程中常用農(nóng)藥有50多種，草莓有60余種，但其實際登記的數(shù)量僅分別為5 種和14 種；且草莓中檢出率比較高的農(nóng)藥有嘧霉胺、多菌靈、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、啶酰菌胺等。而近幾年本單位風(fēng)險摸排中發(fā)現(xiàn)水果檢出較多的農(nóng)藥有嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、甲萘威、甲維鹽、嘧霉胺、噻蟲嗪、吡唑醚菌酯、螺螨酯、丙環(huán)唑、氯唑磷、蟲酰肼、啶氧菌酯等。本研究擬在充分調(diào)研果農(nóng)目前普遍在用農(nóng)藥的基礎(chǔ)上，結(jié)合國家明文規(guī)定的禁限用農(nóng)藥清單、浙江省果蔬例行監(jiān)測參數(shù)和浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險管控（一品一策）相關(guān)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果，通過優(yōu)化前處理方法和測定條件，建立水果中38 種農(nóng)藥多殘留的QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯苯嘧啶醇、呋蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、3-羥基克百威、啶蟲脒、噻蟲啉、克百威、甲萘威、甲霜靈、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、嘧菌酯、氯嘧磺隆、多效唑、戊炔草胺、三唑酮、嘧霉胺、腈菌唑、氯唑磷、氟環(huán)唑、啶氧菌酯、蟲酰肼、丙環(huán)唑、吡唑醚菌酯、辛硫磷、茚蟲威、烯唑醇、多殺菌素、肟菌酯、硫線磷、唑蟲酰胺、甲維鹽、唑螨酯、螺螨酯、氟啶脲、噠螨靈（均為液態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

C18（40～63 μm）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～63 μm）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）（120～400 目）、酸性氧化鋁（7G010005）、堿性氧化鋁（AG010005）、硅藻土（545） 德國CNW公司；弗羅里硅土（0.150～0.250 mm） 美國WZ.der.Floridin公司；超純硅膠（60～200 μm） 加拿大Silicycle公司；無水硫酸鎂（分析純） 西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯（均為色譜純）德國默克公司；0.22 μm濾膜、1 mL注射器、2 mL樣品瓶上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水由Milli-Q Direct 8超純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ QUANTUM ACCESS MAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國熱電公司；MS7610-33旋渦振蕩器 美國Thermo Fisher公司；TG16-WS離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；ROTINA 380離心機 德國海蒂詩公司；AR1502CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.00 g樣品于50 mL離心管中，加入10.00 mL 1%甲酸-乙腈，混勻后再加入2.5 g無水硫酸鎂，渦旋1 min后6 000 r/min離心5 min。取1.5 mL上清液于2 mL離心管，加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg C18、50 mg PSA、50 mg硅藻土，渦旋30 s后10 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物混合中間液1（1 μg/mL）：準(zhǔn)確移取38 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.100 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10.0 mL，于4 ℃冰箱冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)物混合中間液2（3.8 μg/mL，以噻蟲嗪計）：按38 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儀器定量限比例，分別移取一定體積的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10.0 mL，于4 ℃冰箱冷藏保存。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1：臨用時用1%甲酸-乙腈溶液溶解的樣品空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)物混合中間液1，稀釋成1、2、5、10、20、50 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，用于確定儀器檢出限、定量限。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2：臨用時用1%甲酸-乙腈溶液溶解的樣品空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)物混合中間液2，稀釋成20、40、100、200、400、1 000 μg/L（以噻蟲嗪計）系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，用于確定方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 高效液相色譜條件

Accucore aQ色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；進樣量10 μL，流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；流動相A為0.1%甲酸溶液（內(nèi)含0.1 g/L甲酸銨），流動相B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

同時，《指導(dǎo)意見》提出要從10個方面強化各項到村到戶到人的精準(zhǔn)幫扶舉措，包括：加大產(chǎn)業(yè)扶貧力度，全力推進就業(yè)扶貧，深入推動易地扶貧搬遷，加強生態(tài)扶貧，著力實施教育脫貧攻堅行動，深入實施健康扶貧工程，加快推進農(nóng)村危房改造，強化綜合性保障扶貧，開展貧困殘疾人脫貧行動，開展扶貧扶志行動。

表 1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for HPLC

1.3.3.2 串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源，正離子掃描模式；離子源溫度350 ℃；噴霧電壓3 500 V；毛細管溫度300 ℃；鞘氣壓力（氮氣）35 Arb；離子源電流4.0 μA；輔助氣壓力10 Arb；數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化錐孔氣流、毛細管電壓等儀器條件設(shè)置，篩選高響應(yīng)特異離子對等質(zhì)譜條件，采用正離子掃描反應(yīng)監(jiān)測模式的方式一針進樣完成對所有目標(biāo)物的檢測。具體結(jié)果見表2。

表 2 38 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for 38 pesticides

續(xù)表2

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取

表 3 不同提取方法的38 種農(nóng)藥總體回收率Table 3 Effect of different extraction methods on recoveries of 38 pesticides

選擇甌柑為實驗對象，通過添加回收，考察不同試劑的提取效率。具體過程如下：稱取10.00 g勻漿樣品（每個處理3 個平行），添加標(biāo)準(zhǔn)物，靜置30 min后加入10.00 mL提取試劑，渦旋1 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜檢測，通過計算38 種農(nóng)藥的回收率考察提取效果。

2.2.2 凈化

表 4 不同凈化劑凈化后的38 種農(nóng)藥總體回收率Table 4 Effect of different purification methods on recoveries of 38 pesticides

本實驗除對QuEChERS方法常用凈化材料C18、PSA、GCB進行考察外，還對超純硅膠、弗羅里硅土、硅藻土、氧化鋁等常見的固相萃取柱填料進行考察。由于GCB能夠強烈吸附色素類物質(zhì)，同時無選擇性的對非極性農(nóng)藥也有吸附作用，降低大部分農(nóng)藥的回收率[27-28]。因此，本研究考察C18、PSA、GCB、超純硅膠、弗羅里硅土、硅藻土、氧化鋁等備選凈化材料對待測物回收率的影響。具體步驟如下：在2.2.1節(jié)優(yōu)化的提取條件下，取1.5 mL空白樣品提取液（加標(biāo)物）于2 mL離心管中，加入100 mg無水硫酸鎂、25 mg凈化劑（每個處理3 個平行），渦旋30 s，10 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。通過計算38 種農(nóng)藥的回收率考察凈化劑對目標(biāo)物的吸附情況，結(jié)果顯示除C18、PSA和硅藻土外，其他凈化劑均對少數(shù)目標(biāo)物有一定的吸附，導(dǎo)致個別目標(biāo)物回收率偏低（表4）。為提高凈化效果，降低基質(zhì)效應(yīng)，本實驗考察50 mg C18、PSA和硅藻土及其組合對目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果顯示增加凈化劑的添加量，對目標(biāo)物的回收率影響不大（表4）。故本實驗最終選擇50 mg C18＋50 mg PSA＋50 mg硅藻土作為凈化劑。

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限結(jié)果

表 5 38 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear ranges, LODs and LOQs of 38 pesticides

在1.3.2節(jié)色譜質(zhì)譜條件下，空白樣品中添加一系列質(zhì)量濃度的目標(biāo)化合物，配制目標(biāo)物的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（校準(zhǔn)曲線應(yīng)包括基質(zhì)空白且至少有一個檢出限附近的水平狀態(tài)），經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定后，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x/（μg/L）），質(zhì)譜定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由GB/T 33260.2—2018《檢出能力 第2部分：線性校準(zhǔn)情形檢出限的確定方法》計算目標(biāo)物的檢出限與定量限[29]。實驗結(jié)果表明，檢出限在0.3～26.2 μg/kg之間，定量限在0.6～52.4 μg/kg之間，具體結(jié)果見表5。

確定每個目標(biāo)物的定量限后，按一定的比例配制高質(zhì)量濃度混標(biāo)目標(biāo)物儲存液。在空白樣品提取液中添加一系列質(zhì)量濃度上述混標(biāo)目標(biāo)物儲存液，每個添加水平6 次重復(fù)，計算線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果表明，目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)（R）在0.999 5～0.999 9之間，能夠滿足定量分析的基本要求，具體結(jié)果見表5。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行殘留測定時應(yīng)盡量避免基質(zhì)效應(yīng)[30]，同時基質(zhì)效應(yīng)也可反映凈化效果。本研究采用相對響應(yīng)值法對基質(zhì)效應(yīng)進行評價（基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值），基質(zhì)效應(yīng)大于1為基質(zhì)增強效應(yīng)，反之則為基質(zhì)抑制效應(yīng)[10]；對甌柑進行基質(zhì)效應(yīng)評價，實驗結(jié)果表明38 種目標(biāo)物均為基質(zhì)抑制。未加凈化劑（僅提取，不凈化）時，基質(zhì)效應(yīng)在0.58～0.72之間；加凈化劑（既提取，又凈化）時，基質(zhì)效應(yīng)在0.66～0.98之間?；|(zhì)效應(yīng)對38 種目標(biāo)物影響較大，因此必須使用基質(zhì)標(biāo)或添加同位素內(nèi)標(biāo)的方式消除基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.3.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

在甌柑中添加適當(dāng)體積的38 種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平均分別為定量限、2 倍定量限和10 倍定量限。由表6可知，38 種化合物的平均加標(biāo)回收率在70.1%～119.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～12.4%之間，方法具有較好的回收率和重復(fù)性。

表 6 38 種農(nóng)藥的加標(biāo)平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Average spiked recoveries and relative standard deviations of 38 pesticides

續(xù)表6

2.4 實際樣品測定結(jié)果

運用建立的檢測方法，對實際樣品進行分析。131 批次楊梅樣品累計檢測出8 種農(nóng)藥，嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、甲萘威、甲維鹽、嘧霉胺、噻蟲嗪的檢出率較高，檢出率均高于3%。63 批次草莓樣品累計檢測出7 種農(nóng)藥，嘧霉胺、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺、噻蟲嗪、3-羥基克百威、嘧菌酯、克百威的檢出率較高，檢出率均高于3%。40 批次橘子、冬棗、葡萄、蘋果、桃子、香蕉等其他水果檢測出18 種農(nóng)藥，噻蟲嗪、吡唑醚菌酯、吡蟲啉、嘧菌酯、螺螨酯、丙環(huán)唑、嘧霉胺、氯唑磷、蟲酰肼、啶蟲脒、啶氧菌酯的檢出率較高，檢出率均高于3%。此外本研究還對蔬菜樣品進行檢測，60 批次大白菜、菠菜、芹菜、小青菜、豇豆、西紅柿、辣椒、胡蘿卜等蔬菜樣品累計檢測出19 種農(nóng)藥，噻蟲嗪、啶蟲脒、吡唑醚菌酯、丙環(huán)唑、三唑酮、甲霜靈、烯唑醇、吡蟲啉、嘧霉胺、氯蟲苯甲酰胺、甲維鹽、唑蟲酰胺、3-羥基克百威、克百威、氯唑磷、螺螨酯的檢出率較高，檢出率均高于3%。實際樣品的具體檢測結(jié)果見表7、圖1。

表 7 樣品檢測結(jié)果Table 7 Summary of analytical results for the determination of 38 pesticide residues in real samples

圖 1 樣品檢出參數(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測圖Fig. 1 MRM chromatograms showing the retention times of pesticide residues in real samples

3 結(jié) 論

利用基質(zhì)分散固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立常見水果中農(nóng)藥殘留多指標(biāo)同步定性、定量檢測技術(shù)。該方法使用改良的QuEChERS前處理技術(shù)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。對測定方法進行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明，38 種農(nóng)藥的方法檢出限在0.3～26.2 μg/kg之間，定量限在0.6～52.4 μg/kg之間，線性相關(guān)系數(shù)（R）在0.999 5～0.999 9之間；平均加標(biāo)回收率在70.1%～119.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～12.4%之間。該方法準(zhǔn)確、快捷，對于推進政府監(jiān)管部門執(zhí)法、提高檢測效率、降低檢測成本、推進第三方檢測市場整體技術(shù)進步等均具有重要的實踐意義和社會效益，可應(yīng)用于食品安全日常監(jiān)測及突發(fā)事件應(yīng)急處置工作中。