范盈盈，胡東強(qiáng)，張銳利，李曉龍，何偉忠，華震宇，李 靜，武愛(ài)波，王 成

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊），新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；3.中國(guó)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)代謝與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，上海 200031；4.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；5.昌吉州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，新疆 昌吉 831100；6.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，新疆 烏魯木齊 830091）

紅棗（Ziziphus jujubaMill.）富含果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖，以及鉀、磷、鈣、錳、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜酸、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種廣受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎的藥食同源的果品[1]。中國(guó)是世界上最大的紅棗生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，而新疆紅棗年產(chǎn)量300多萬(wàn) t[2]，占全國(guó)的30%以上，居全國(guó)首位[3]。新疆紅棗的品種按產(chǎn)量分主要有駿棗、灰棗和哈密大棗，其中駿棗呈橢圓形，個(gè)大，皮薄，口感偏酸，主要種植在南疆環(huán)塔里木盆地的阿克蘇、喀什、和田等地州；灰棗個(gè)小，果肉密實(shí)，味甜，主要種植在南疆巴音郭楞蒙古自治州的若羌、庫(kù)車(chē)等地；哈密大棗呈圓形，大小介于駿棗和灰棗之間，主要種植在東疆的哈密地區(qū)。目前，紅棗產(chǎn)業(yè)是新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是最具資源優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)業(yè)[4]。然而，自2010年以來(lái)，“黑斑病”已成為危害新疆紅棗最大的病害，造成平均產(chǎn)量損失超過(guò)30%，嚴(yán)重時(shí)超過(guò)50%[5-6]。

黑斑病不僅給新疆的支柱產(chǎn)業(yè)帶來(lái)產(chǎn)量損失，而且給采后果品的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)造成了巨大影響。正常紅棗果肉的顏色在生長(zhǎng)期是從青色到暗紅色，而黑斑病紅棗感病部位的果肉顏色則是從淡紅色到黑色。紅棗感病部位肉質(zhì)堅(jiān)硬、腐爛、有澀味，不同于正常紅棗的軟和甜味。許瑛等[7]發(fā)現(xiàn)，與健康棗果相比，發(fā)病‘駿棗’鮮果在硬度、質(zhì)量、含水量、亮度、色差等外觀品質(zhì)明顯下降；VC、蛋白質(zhì)、含糖量、可滴定酸等內(nèi)在品質(zhì)均明顯下降。

黑斑病的主要致病菌為鏈格孢霉菌，侵染紅棗后可產(chǎn)生鏈格孢毒素。鏈格孢毒素具有致畸、致癌、致突變作用，主要包括騰毒素（tentoxin，TEN）、細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）、鏈格孢酚甲基醚（alternariol monomethyl ether，AME）等，其中TeA毒性最強(qiáng)，AOH和AME具有急性毒性且可顯示協(xié)同效應(yīng)[8]。

目前，僅有國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)新疆棗果黑斑病有研究，主要集中在黑斑病的危害分布[9-10]、病原鑒定[11-12]、發(fā)生規(guī)律[13-14]以及防治[15-16]等方面，而紅棗感染黑斑病后的品質(zhì)變化、毒素產(chǎn)生情況、食用安全性方面的研究則很少。本研究以南疆不同地區(qū)棗園中采集的健康紅棗和黑斑病紅棗為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)，如糖類(lèi)、氨基酸、總酸、總糖、還原糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素及主要鏈格孢毒素進(jìn)行檢測(cè)分析，最終找到病害棗果變化顯著的代謝物因子，以期為全面研究黑斑病對(duì)南疆紅棗的代謝組學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年紅棗成熟期分別在阿克蘇、喀什、和田等地區(qū)的7 個(gè)縣市棗園的不同方位隨機(jī)采集100 粒黑斑病駿棗（至少含有1 個(gè)黑斑病斑）和100 粒健康駿棗（無(wú)病斑），分別去核混勻后，加入液氮，用刀式研磨儀打碎，-20 ℃冷凍保存，用于后續(xù)棗果營(yíng)養(yǎng)成分和鏈格孢毒素的含量測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

果糖、葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；銅、鉀、鋅、鐵、錳、鎂、鋅、鈣標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 德國(guó)賽卡姆公司；4 種鏈格孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品 奧地利Romer公司；乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸（均為分析純） 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；茚三酮 上海三愛(ài)思公司；苯酚、鹽酸（均為分析純） 廣東光華化學(xué)有限公司；硝酸、過(guò)氧化氫（均為優(yōu)級(jí)純） 德國(guó)Merk試劑公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HM100型刀式研磨儀 北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司；8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；BSA223S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；Mars型微波消解儀 美國(guó)CEM公司；900F型原子吸收分光光度計(jì)美國(guó)PE公司；AFS0820型原子熒光分光光度計(jì) 北京吉天儀器有限公司；LS-5型熒光分光光度計(jì)、UPLCTQD型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；1260 INFINITY型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；S-433D型氨基酸分析儀 德國(guó)SYLM公司；TYE-100型真空干燥濃縮儀 東京理化器械株式會(huì)社；WX-2型真空泵臺(tái)州市楓江創(chuàng)新電機(jī)廠。

1.3 方法

棗果葡萄糖、果糖和蔗糖含量測(cè)定：參考GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定 高效液相色譜法》；還原糖含量測(cè)定：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》，采用直接滴定法；17 種氨基酸含量測(cè)定：參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》，采用氨基酸全自動(dòng)分析儀測(cè)定；總酸含量測(cè)定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》，采用酸堿中和滴定法；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法；礦物質(zhì)元素Fe、Mg、Mn、Ca含量測(cè)定：參考GB/T 5009.90—2003《食品中鐵、鎂、錳的測(cè)定》和GB/T 5009.92—2003《食品中鈣的測(cè)定》，采用原子吸收分光光度法；Cu含量測(cè)定：參考GB/T 5009.13—2003《食品中銅的測(cè)定》，采用火焰原子吸收光譜法；K含量測(cè)定：參考GB/T 5009.91—2003《食品中鉀、鈉的測(cè)定》，采用火焰發(fā)生光譜法。

鏈格孢毒素（AOH、AME、TEN、TeA）的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel建立數(shù)據(jù)系統(tǒng)，用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析，用SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析和營(yíng)養(yǎng)分析評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑斑病對(duì)紅棗中礦物質(zhì)元素的影響

圖 1 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類(lèi)礦物質(zhì)元素含量變化率Fig. 1 Changes in contents of mineral elements in infected jujubes as compared with healthy ones

如圖1所示，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自7 個(gè)棗園中的健康紅棗和黑斑病棗中的7 種礦物質(zhì)元素，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)棗園黑斑病紅棗中的礦物質(zhì)元素含量相比于健康紅棗中的含量分別減少了2.4%～28.7%（Ca）、3.1%～43.0%（Cu）、3.97%～12.73%（Fe）、1.1%～21.9%（K）、2.4%～27.3%（Mg）、1.5%～38.2%（Mn）、7.9%～66.9%（Zn），而且通過(guò)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，黑斑病紅棗和健康紅棗中這7 種礦物質(zhì)在95%的置信區(qū)間內(nèi)變化顯著（P值為0.017～0.046，均小于0.05）。其中，K、Ca、Mg為紅棗中含量較高的礦物質(zhì)元素（＞100 mg/kg）[18]，其在黑斑病棗中的流失情況低于Zn、Mn、Cu等微量元素（＜10 mg/kg）。

2.2 黑斑病對(duì)紅棗中氨基酸含量的影響

圖 2 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類(lèi)氨基酸含量變化率Fig. 2 Changes in contents of amino acids in infected jujubes as compared with healthy ones

如圖2所示，通過(guò)檢測(cè)健康紅棗和黑斑病紅棗中17 種氨基酸的含量發(fā)現(xiàn)，相比于健康紅棗，黑斑病棗中的脯氨酸和天冬氨酸含量顯著降低（配對(duì)檢驗(yàn)P值為0.003～0.008，小于0.05），谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量顯著升高（配對(duì)檢驗(yàn)P值為0.001～0.033，小于0.05），胱氨酸含量降低不顯著（配對(duì)檢驗(yàn)P值為0.322，大于0.05），亮氨酸、絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸含量升高但不顯著（配對(duì)檢驗(yàn)P值為0.092～0.304，大于0.05）。其中苦味氨基酸（Leu、Lys、Arg、Val、His、Phe、Iie、Tyr）含量均升高含量，而含量最高的氨基酸（Pro）為甜味氨基酸，其在病棗中的含量顯著降低，這與紅棗在發(fā)病過(guò)程中果肉變質(zhì)發(fā)苦有很大關(guān)系[19]。

2.3 黑斑病對(duì)紅棗中其他營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

如圖3所示，同一個(gè)棗園黑斑病紅棗中的其他營(yíng)養(yǎng)成分含量相比于健康紅棗中的含量分別減少7.4%～38.9%（總糖）、4.6%～51.4%（還原糖）、8.8%～35.7%（果糖）、47.5%～100%（蔗糖）、5.6%～47.5%（水溶性蛋白質(zhì)）、3.1%～46.6%（總酸），然而葡萄糖含量升高了10.0%～81.8%，根據(jù)配對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果（P值為0.004～0.034，小于0.05）發(fā)現(xiàn)這7 項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均為顯著性變化。這是由于駿棗感染病害后，呼吸作用增強(qiáng)，增加了貯藏物質(zhì)的糖消耗，尤其是二元糖——蔗糖的消耗（在部分黑斑病棗中未檢測(cè)到蔗糖），因而可能造成葡萄糖含量升高、總糖含量降低[20]。

圖 3 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分含量變化率Fig. 3 Changes in contents of nutritional components in infected jujubes as compared with healthy ones

2.4 黑斑病對(duì)紅棗中鏈格孢毒素含量的影響

表 1 不同棗園中健康紅棗和黑斑病棗樣品中鏈格孢毒素的含量Table 1 Contents of Alternaria toxins in infected and healthy jujubes from different orchardsmg/kg

從表1可以看出，TeA在所有樣品中均檢出，而且檢出含量隨著黑斑病感染程度而變化：健康棗（0.161 2～3.839 7 mg/kg）＜病棗（3.105 0～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在大部分的健康紅棗中都未檢出或者低于LOQ，病棗中的檢出含量范圍分別為0.019 6～0.102 7 mg/kg、＜LOQ～1.551 7 mg/kg和＜LOQ～0.029 1 mg/kg。健康棗在運(yùn)輸、保存、處理過(guò)程中可能受到病棗污染，因此有少量鏈格孢毒素檢出。何麗等[21]在不同病級(jí)發(fā)病棗果中也均檢出TeA、AME和AOH，其中TeA檢出含量最高，可達(dá)3 102.27 mg/kg。

2.5 黑斑病對(duì)紅棗中營(yíng)養(yǎng)成分的整體影響

同一棗園中的健康紅棗和黑斑病棗的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有一定的差異性，利用測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)參數(shù)，嘗試構(gòu)建判別模型，判別紅棗是否已感染黑斑病。將測(cè)定的來(lái)自7 個(gè)不同棗園中的健康紅棗和黑斑病棗的31 個(gè)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和4 個(gè)鏈格孢毒素構(gòu)成為14×35的數(shù)據(jù)矩陣。利用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法[22-23]，挖掘差異特征信息，提取特征因子，構(gòu)建紅棗感病判別模型。如圖4a所示，7 個(gè)健康紅棗和7 個(gè)黑斑病棗在前2 個(gè)潛變量空間的投影可以明顯區(qū)分。如圖4b所示，AOH、ASP、TeA對(duì)第1個(gè)潛變量具有較大貢獻(xiàn)，而蛋白質(zhì)、Mg、Ser對(duì)第2潛變量具有較大貢獻(xiàn)。如圖4c所示，AOH、Asp、Met、TeA、Lys等是紅棗PLS-DA發(fā)病判別模型最主要的特征變量（VIP值＞1）。

圖 4 基于PLS-DA的健康紅棗和黑斑病棗的判別模型Fig. 4 PLS-DA based identification model for infected versus healthy jujubes

3 討論與結(jié)論

由于駿棗皮薄、肉質(zhì)疏松，并且矮化密植、惡劣天氣等因素，特別容易受到鏈格孢霉菌侵染，從而易得黑斑病[24]。白劍宇等[25]以3 種不同栽培模式的不同黑斑病發(fā)病程度的駿棗為研究對(duì)象，檢測(cè)10 種主要營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)總糖、還原糖、蔗糖、黃酮、VC、Ca、P、Fe、Zn等營(yíng)養(yǎng)成分的含量與棗黑斑病危害級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。許瑛等[7]對(duì)不同黑斑病發(fā)病程度的駿棗和灰棗進(jìn)行外觀及內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)2 種病棗中的VC、蛋白質(zhì)、含糖量、可滴定酸等含量均明顯下降，而且在2 種病棗中均檢測(cè)到TeA、AME和AOH這3 種鏈格孢毒素。本課題組[26]曾對(duì)3 種紅棗（哈密大棗、和田駿棗和若羌灰棗）接種黑斑病病原菌——鏈格孢菌（Alternaria alternata）和細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima），用超高效液相色譜-離子阱軌道-高分辨質(zhì)譜進(jìn)行代謝物篩查，發(fā)現(xiàn)感染了病原菌的棗果中有4 種皂苷、3 種有機(jī)酸、3 種生物堿含量顯著下降，鏈格孢毒素TeA和AOH顯著升高。

本研究采集的紅棗主要來(lái)自阿克蘇、和田兩地兵團(tuán)的7 個(gè)連隊(duì)棗園的矮化密植的駿棗。經(jīng)過(guò)檢測(cè)健康紅棗和黑斑病棗中的7 種礦物質(zhì)元素、17 種氨基酸、3 種糖類(lèi)、總酸、總糖、蛋白質(zhì)、還原糖等31 項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：1）病棗中所檢測(cè)的7 種礦物質(zhì)元素含量顯著下降，說(shuō)明果實(shí)在病變過(guò)程中礦物質(zhì)元素均有不同程度的流失[27]，且K、Ca、Mg等紅棗中含量較高的礦物質(zhì)元素在黑斑病棗中的流失情況低于Zn、Mn、Cu等微量元素。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[28]棗果中的Ca含量與裂果密切相關(guān)，而裂果也是紅棗黑斑病的誘因之一。2）相比于健康紅棗，黑斑病棗中的一些苦味氨基酸含量（Val、Iie、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg）均升高，甜味氨基酸含量（Pro）顯著降低，這與紅棗在發(fā)病過(guò)程中果肉變質(zhì)發(fā)苦有關(guān)。3）紅棗感染黑斑病后，果糖、葡萄糖、蔗糖、還原糖、總糖、總酸、水溶性蛋白質(zhì)等明顯降低，這是由于駿棗感染病害后，呼吸作用增強(qiáng)，增加了貯藏物質(zhì)的糖消耗，因而糖含量降低。4）毒性最強(qiáng)的TeA在所有的樣品中均檢出，且含量最高，其在健康棗中檢出含量（0.161 2～3.839 7 mg/kg）顯著低于黑斑病棗（3.105～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在所有的健康紅棗中都未檢出或者低于定量限，在病棗中的檢出量較低。5）通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)AOH、Asp、Met、TeA和Lys為主要判別健康紅棗和病棗的區(qū)分因子。由此可以猜測(cè)黑斑病中鏈格孢毒素AOH和TeA的生物合成[29-30]可能與氨基酸Asp、Met和Lys有關(guān)。

綜上所述，新疆紅棗感染黑斑病后，多種營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生顯著變化，并主要產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物——鏈格孢毒素，其中健康紅棗和黑斑病棗的5 個(gè)主要區(qū)分因子中，AOH和TeA為有毒代謝產(chǎn)物，Asp、Met和Lys為主要營(yíng)養(yǎng)成分，推測(cè)這5 個(gè)因子可能存在一定的代謝關(guān)系，具體代謝途徑還有待于后期的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究結(jié)果可為闡釋新疆紅棗黑斑病變過(guò)程中鏈格孢毒素的產(chǎn)生機(jī)理提供理論依據(jù)。