徐曉梅，溫家穎，王慶華,

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

α-葡萄糖苷酶是人體腸道內(nèi)碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶類，它對(duì)包括糖蛋白及糖脂的形成以及碳水化合物在小腸內(nèi)部的消化過程和控制體內(nèi)血糖水平起著舉足輕重的作用[1-2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸黏膜刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶，能顯著延緩碳水化合物向單糖的轉(zhuǎn)化，降低飯后的血糖峰值[3-4]。世界衛(wèi)生組織根據(jù)現(xiàn)今糖尿病的發(fā)病率預(yù)測(cè)大概到2025年全球可能有3億，甚至更多的人會(huì)患糖尿病，或受到糖尿病的干擾和威脅[5]。α-葡萄糖苷酶抑制劑已經(jīng)被我國(guó)糖尿病防治指南建議為一線藥物，尤其適用于喜食含高碳水化合物食物的東方人群[6-7]。除此之外，該領(lǐng)域?qū)W者更希望能通過提倡對(duì)輔助降血糖食品的食用，用食療的方法調(diào)節(jié)血糖水平，有效預(yù)防糖尿病。在輔助降糖保健食品中糖類及其類似物質(zhì)作為重要的α-葡萄糖苷酶抑制劑之一，在降血糖方面起著十分重要的作用。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)[8]的方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，分子對(duì)接技術(shù)是其重要的組成部分。分子對(duì)接技術(shù)[9]則是基于藥物分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)過程中一個(gè)很關(guān)鍵的方法，它是利用空間構(gòu)象和相互作用在結(jié)合位點(diǎn)之間不斷地去定位和去尋找出最佳的匹配狀態(tài)。AutoDock是美國(guó)Scripps研究所Olson實(shí)驗(yàn)室開發(fā)與維護(hù)的一款分子對(duì)接模擬軟件，主要應(yīng)用于配體-蛋白質(zhì)分子對(duì)接，用來預(yù)測(cè)生物大分子和小分子配體之間的相互作用的自動(dòng)化程序[10-11]。AutoDock優(yōu)勢(shì)在于通過快速的基于格點(diǎn)能量的計(jì)算方法和有效的扭轉(zhuǎn)自由度搜索方法這兩種方法，很好地平衡了精準(zhǔn)計(jì)算與合理計(jì)算資源之間的矛盾，大大節(jié)省了科研人員耗費(fèi)在晶體結(jié)構(gòu)修飾的時(shí)間[12-14]。

本研究利用AutoDock軟件對(duì)20 種小分子單糖及其類似物與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行模擬對(duì)接，探索其作用的機(jī)理，通過合理藥物設(shè)計(jì)的方法結(jié)合受體與配體的相互作用規(guī)律，進(jìn)一步優(yōu)化改造提取物質(zhì)抑制劑分子結(jié)構(gòu)，以期為獲取更高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

AutoDock 4.2及AutoDock Tools 1.5.6軟件從官網(wǎng)（http://autodock.scripps.edu/）下載，α-葡萄糖苷酶的3D結(jié)構(gòu)程序數(shù)據(jù)庫文件（program database file，PDB）從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載，編號(hào)為2QMJ，保存。20 種小分子結(jié)構(gòu)sdf文件從Pubmed數(shù)據(jù)庫下載，再通過Openbabel軟件把sdf格式轉(zhuǎn)換為PDB格式保存。

1.2 AutoDock 4.2軟件分子對(duì)接步驟及對(duì)接參數(shù)的設(shè)置

1.2.1 配體和受體的預(yù)處理

經(jīng)軟件Swiss-PdbViewer 4.1分析發(fā)現(xiàn)2QMJ文件里的蛋白結(jié)構(gòu)缺失了7 個(gè)氨基酸氨基酸殘基，分別是Ser1、Ala2、Glu3、Cys4、Pro5、Val6、Gln837，補(bǔ)全氨基酸殘基，得到完整的受體結(jié)構(gòu)PDB文件。將補(bǔ)全氨基酸殘基后的2QMJ文件導(dǎo)入到AutoDock中，刪去2QMJ受體文件所含的NAG、GOL、ACR等基團(tuán)，去水加氫，計(jì)算Gasteiger電荷，合并非極性氫原子，文件保存為2QMJ.pdbqt[15-16]。AutoDock 4.2可以選擇柔性或剛性對(duì)接，但選取柔性基團(tuán)的不確定因素較多，因此本實(shí)驗(yàn)仍采取剛性形式對(duì)接。AutoDock讀入配體，合并非極性氫原子，加Gasteiger電荷，使其保持最小能量狀態(tài)[17-18]，將文件保存為Acrbose.pdbqt。AutoDock Tools 1.5.4軟件中的Ligand子程序包可自動(dòng)檢測(cè)可旋轉(zhuǎn)鍵的個(gè)數(shù)，在對(duì)接過程中，這些鍵可以靈活旋轉(zhuǎn)與受體分子對(duì)接。

1.2.2 配體受體對(duì)接過程

將2QMJ酶的氨基酸殘基序列導(dǎo)入BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示2QMJ的活性位點(diǎn)在第300～600位氨基酸殘基之間，確定以第441位氨基酸殘基Trp441坐標(biāo)作為中心坐標(biāo)，坐標(biāo)值為（-21.56，-6.936，-1.971）。對(duì)接參數(shù)格點(diǎn)間距設(shè)置為0.375 ?，大小為60 ?×60 ?×60 ?，其大小能夠保證配體完全處在酶活性中心范圍內(nèi)，配體構(gòu)象搜索過程使用半經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)與拉馬克遺傳算法[19]。由于本次選取的20 個(gè)小分子的柔性鍵不多，故算法對(duì)接的輪數(shù)設(shè)為50，在分子對(duì)接運(yùn)行過程中，能量評(píng)估的最大數(shù)目，平移步驟大小及其他參數(shù)取默認(rèn)值[20]。

1.3 新型小結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

在Window寫字板中打開所需改造小分子結(jié)構(gòu)PDB的文件，將目標(biāo)原子更改為新的原子字母符號(hào)，重新保存為PDB文件，即可得到新的配體分子結(jié)構(gòu)的PDB文件用于對(duì)接實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

圖表以Excel軟件繪制，以SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。相關(guān)小分子與酶對(duì)接的圖均由AutoDock軟件導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)接方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

選取臨床降血糖常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行對(duì)接，以驗(yàn)證AutoDock 4.2參數(shù)設(shè)置的準(zhǔn)確性。將2QMJ結(jié)構(gòu)活性中心所結(jié)合的ACR（即阿卡波糖分子）取出作為配體，與刪去了此配體的2QMJ酶重新對(duì)接。結(jié)果顯示對(duì)接結(jié)合自由能最低為-7.63 kcal/mol，其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值為1.99，小于2。一般認(rèn)為RMSD值小于2，即可保證小分子配體與受體進(jìn)行有效對(duì)接[21-22]。圖1B為Acrbose1_1與2QMJ活性中心的對(duì)接結(jié)果，可見阿卡波糖已經(jīng)成功地嵌入α-葡萄糖苷酶表面的活性中心中，說明本實(shí)驗(yàn)的參數(shù)設(shè)置合適，能較合理地模擬抑制劑與酶在活性中心的結(jié)合構(gòu)象，對(duì)接方法可信。

圖 1 阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果圖Fig. 1 Molecular docking between acarbose and α-glucosidase

2.2 20 種小分子單糖及其類似物的分子對(duì)接

20 種小分子的活性數(shù)據(jù)及軟件預(yù)測(cè)的最低對(duì)接結(jié)合自由能見表1。本研究所采用20 種小分子單糖及類似物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性IC50的數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[23]。以對(duì)接結(jié)合自由能（每種配體分子選擇構(gòu)象最低的結(jié)合自由能）為橫坐標(biāo)，抑制劑pIC50為縱坐標(biāo)，考察20 種小分子單糖及類似物的對(duì)接結(jié)合自由能與pIC50關(guān)系，其回歸方程為：y=-0.936 2x-3.923 7，r=0.738 9。從r值看，結(jié)合自由能和pIC50具有很緊密的相關(guān)性。上述結(jié)果顯示由AutoDock 4.2預(yù)測(cè)的結(jié)合自由能與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的pIC50存在可以接受的相關(guān)性，從另一方面說明通過AutoDock 4.2的分子對(duì)接大致可以預(yù)測(cè)抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶IC50。

表 1 20 種小分子對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及對(duì)接結(jié)合自由能Table 1 Inhibitory effects and binding free energy of 20 small molecules and their analogues against α-glucosidase

通過AutoDock和UCSF Chimera P軟件[24]分析20 種小分子配體與酶對(duì)接后的復(fù)合物和α-葡萄糖苷酶之間的氫鍵作用。發(fā)現(xiàn)酶活性中心點(diǎn)氨基酸殘基中，Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526最容易與小分子配體的H、O原子形成氫鍵作用，這些氨基酸殘基在與小分子結(jié)合時(shí)發(fā)揮較為重要的作用，尤其以Asp542、Asp327和Asp443與小分子配體形成氫鍵的機(jī)會(huì)最大，這是因?yàn)锳sp側(cè)鏈基團(tuán)為羧基，其上的兩個(gè)氧原子很容易與小分子配體上的氫形成氫鍵。此外范得華力和靜電相互作用等非鍵相互作用在酶活性中心與小分子配體形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象中也起了非常重要的作用。圖2顯示了1-脫氧野尻霉素和井岡霉按與α-葡萄糖苷酶活性中心氨基酸殘基之間的相互作用。

圖 2 1-脫氧野尻霉素（A）和井岡霉胺（B）與α-葡萄糖苷酶對(duì)接氫鍵作用圖Fig. 2 Hydrogen bonding of 1-deoxynojirimycin (A) and validamine (B)with α-glucosidase

2.3 假單糖分子的分子對(duì)接

在20 個(gè)小分子中，1-脫氧野尻霉素的對(duì)接結(jié)合自由能為-8.26 kcal/mol，井岡霉胺為-8.79 kcal/mol，大大低于其他化合物，說明兩種化合物與酶的結(jié)合較為牢固，這與兩者同屬于強(qiáng)效α-葡萄糖苷酶抑制劑的性質(zhì)一致。雖然其中的單糖分子結(jié)構(gòu)與1-脫氧野尻霉素、井岡霉胺等結(jié)構(gòu)相似，但這些單糖與后兩者的對(duì)接結(jié)合自由能卻相差很大，提示1-脫氧野尻霉素和井岡霉胺環(huán)上的N原子和C原子可能是影響對(duì)接結(jié)合自由能的重要因素。將其中的8 種單糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、海藻糖、果糖、2-脫氧-D-葡萄糖和6-脫氧-D-葡萄糖）糖環(huán)上的O原子分別替換為N原子和C原子，構(gòu)建新的假單糖化合物與酶進(jìn)行對(duì)接，比較每種單糖與原子替換后的N假單糖和C假單糖的結(jié)合自由能，結(jié)果見表2。

表 2 8 種單糖與假單糖分子對(duì)接結(jié)合自由能Table 2 Binding free energies of eight monosaccharides with pseudomonosaccharide molecules

單糖與N假單糖兩組間對(duì)接結(jié)合自由能t檢驗(yàn)結(jié)果：t=8.76×10-10，顯示兩組間結(jié)合自由能存在顯著性差異，說明把單糖糖環(huán)上的O替換為N后，假單糖分子對(duì)接結(jié)合自由能減小，可見新構(gòu)建的假糖分子比相應(yīng)的單糖分子與酶的結(jié)合能力更強(qiáng)。

單糖與C假單糖兩組間對(duì)接結(jié)合自由能t檢驗(yàn)結(jié)果：t=0.34，兩組間無顯著差異，說明把單糖糖環(huán)上的O原子替換為C原子后，假糖分子和單糖分子的對(duì)接結(jié)合自由能的差異無意義，單糖糖環(huán)上的O原子替換為C原子不影響單糖分子與受體的結(jié)合，同時(shí)也從另一個(gè)方面顯示了N原子對(duì)此類結(jié)構(gòu)的化合物與酶活性中心結(jié)合的重要性。

2.4 假井岡霉胺分子對(duì)接

對(duì)接結(jié)果中井岡霉胺的結(jié)合自由能是最小的，其結(jié)構(gòu)與單糖分子亦相似，差別在于側(cè)鏈有—NH2和雜環(huán)內(nèi)的O原子。根據(jù)這一特點(diǎn)，用軟件設(shè)計(jì)了5 種形式改造的假井岡霉胺分子，用AutoDock分別與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行對(duì)接。井岡霉胺結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖 3 井岡霉胺結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3 Chemical structure of validamine

表 3 井岡霉胺改造后的對(duì)接結(jié)合自由能Table 3 Binding free energy after modification of validamine

表3顯示，化合物2、4中，不管在R1位還是R2位，只要引入N原子，對(duì)接結(jié)合自由能與井岡霉胺的結(jié)果基本一致；化合物1、3中，R1和R2位均無N原子，對(duì)接結(jié)合自由能較大，顯示與酶的結(jié)合能力減弱；化合物5中，R1和R2位同時(shí)引入N原子，對(duì)接結(jié)合自由能明顯變小，結(jié)合程度變得更牢固。上述結(jié)果提示，在類似的小分子結(jié)構(gòu)中，N原子在與α-葡萄糖苷酶對(duì)接中起著非常重要的作用。含N原子的六元雜環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子帶—NH2取代基后，能大大提高配體與受體的親和力，其可能原因是N原子替換后，雖然這些生物電子等排體的鍵角和空間結(jié)構(gòu)非常相近，但是電負(fù)性和疏水性不同，因此替換后會(huì)發(fā)生生物活性改變，與受體的親和力也隨之變化[25]。

3 結(jié) 論

對(duì)接結(jié)合自由能打分是AutoDock分子對(duì)接技術(shù)關(guān)于對(duì)接結(jié)果優(yōu)劣的最簡(jiǎn)單、最直接的評(píng)價(jià)，對(duì)接結(jié)果給出的結(jié)合自由能越低則打分越高，打分最高構(gòu)象配體與受體的結(jié)合是最牢固的結(jié)合模式[26-28]。本研究中20 種小分子化合物對(duì)接結(jié)合自由能與其抑制實(shí)驗(yàn)中得到的pIC50數(shù)據(jù)基本呈負(fù)相關(guān)，說明小分子與酶對(duì)接結(jié)合自由能越小，抑制效果越好。從對(duì)接結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526易與小分子配體的H、O形成氫鍵，其中顯示Asp542和His600對(duì)酶活性最為重要。單糖分子改造后的結(jié)果顯示是N原子的存在使得氫鍵更易產(chǎn)生，大大增強(qiáng)了配體與受體的結(jié)合和穩(wěn)定程度。對(duì)井岡霉胺分子進(jìn)行5 種形式改造后，當(dāng)分子結(jié)構(gòu)環(huán)內(nèi)引入N原子或有NH2取代基時(shí)，對(duì)接結(jié)合自由能明顯變小，結(jié)合程度變得更強(qiáng)。以往也有研究人員在酶活性抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)很多胺類物質(zhì)是許多糖苷酶的抑制劑，并認(rèn)為堿性糖衍生物（特別是糖胺）比相應(yīng)的中性類似物具有更強(qiáng)的抑制葡萄糖苷酶活性的能力[23]，岳保珍等[29]發(fā)現(xiàn)3 種氮雜糖對(duì)α-或β-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。雖然本研究所構(gòu)建的假單糖或假井岡霉胺分子不一定存在，但研究結(jié)果顯示N原子在α-葡萄糖苷酶抑制劑設(shè)計(jì)中具有很重要的意義，未來可以更多關(guān)注含N雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，提取或合成此類具有更強(qiáng)活性的α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

相較于單純純化學(xué)合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑，天然來源的具有綠色、安全、毒副作用小等特點(diǎn)。然而植物來源α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究也存在一定局限性，目前研究著重于分離和提取單體化合物并利用體外酶活性篩選模型篩選活性單體，但在天然活性化合物的藥物化學(xué)、藥理學(xué)及臨床研究方面尚有欠缺[21,30]。本研究借助AutoDock軟件對(duì)20 種小分子單糖及其類似物與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行模擬對(duì)接研究，探索其作用的機(jī)理，以便通過合理藥物設(shè)計(jì)的方法結(jié)合受體與配體的相互作用規(guī)律，進(jìn)一步優(yōu)化改造提取的抑制劑分子結(jié)構(gòu)，為更高效葡萄糖苷酶抑制劑的獲取提供了新思路。