基于GC-MS、DSA結(jié)合PLSR研究羊脂處理方式對熱反應(yīng)體系風(fēng)味形成的影響

馬雪平，詹 萍*，田洪磊*，未志勝，李凱旋

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

肉味香精作為一種重要的食品添加劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個領(lǐng)域，不僅可以有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味和口感，滿足人們對于肉味口感的追求，而且營養(yǎng)較為豐富，不易致人發(fā)胖，已經(jīng)越來越被人們喜愛[1]。肉類風(fēng)味是基于受熱狀態(tài)的存在而促發(fā)，生肉只有微弱或無香味[2]。肉中的各種風(fēng)味前體在加熱過程中發(fā)生各種復(fù)雜的反應(yīng)而產(chǎn)生香氣，這些導(dǎo)致肉類風(fēng)味產(chǎn)生的基本反應(yīng)包括美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化降解及脂質(zhì)與美拉德反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)等，如氨基酸、小分子肽類和還原糖等水溶性成分通過美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生基本的肉味[3-5]；脂質(zhì)則通過其自身的氧化降解反應(yīng)生成一系列低分子的醛類、醇類、酮類和酸類等揮發(fā)性化合物[6]。這些物質(zhì)具有極低的風(fēng)味閾值，一方面，對于肉類風(fēng)味的呈現(xiàn)具有重要的作用，另一方面，脂肪氧化所生成的醛類、酮類和羧酸等含羰基的化合物在反應(yīng)過程中，作為肉類風(fēng)味的前體物質(zhì)與其他美拉德反應(yīng)的中間體存在競爭機制，改變原有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物形成途徑及其產(chǎn)物從而改善并控制理想風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[7]。因此，通過控制脂肪的氧化水平，在很大程度上對于模擬肉類風(fēng)味產(chǎn)品整體風(fēng)味的提升具有重要的意義。

然而亦有研究表明，在通過脂肪高溫氧化熱反應(yīng)過程而賦予肉類特征風(fēng)味的同時，也存在部分熱反應(yīng)產(chǎn)物油脂味過重以及脂肪高溫氧化過程中的安全隱患問題[8]。為了解決這些問題，提出“酶解-低溫氧化”的方法制備氧化脂肪的特征風(fēng)味前體，這意味著脂肪的初始水解首先在脂肪酶的存在下進行，然后在低溫條件下進一步熱氧化以獲得氧化脂肪。這個過程可為特征風(fēng)味前體物質(zhì)的生成做準備，同時降低高溫氧化帶來的安全隱患問題。

目前針對脂質(zhì)為前體制備相關(guān)肉類風(fēng)味基料已開展了大量相關(guān)研究[9-11]，多集中于調(diào)控氧化工藝對熱反應(yīng)風(fēng)味的影響，對于酶解-調(diào)控氧化脂肪尤其是針對酶解-調(diào)控氧化羊脂對于羊肉風(fēng)味的報道相對較少，對其參與熱反應(yīng)中各種風(fēng)味物質(zhì)的形成途徑研究的報道尚屬空白。因此，本實驗研究5 種不同處理方式羊脂的揮發(fā)性化合物差異及不同處理方式羊脂對模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，最終為制備羊肉特征風(fēng)味基料確定羊脂處理方式，同時為深入了解不同處理方式羊脂參與美拉德反應(yīng)機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊脂 天津天源油脂有限公司；脂肪酶（7 500 lu/g）上海源葉生物科技有限責(zé)任公司；半胱氨酸（食品級）天津市光復(fù)精細化工研究院；葡萄糖（食品級） 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；正構(gòu)烷烴混合標準品（C7～C40）、1,2-二氯苯（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GX-2015超級恒溫循環(huán)器 上海谷寧實業(yè)有限公司；油浴鍋、美拉德高溫反應(yīng)瓶、PHS-W型pH計 上海般特儀器有限公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海梅香儀器有限公司；固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭） 美國Supelco公司；7890B-5977A14型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 不同處理羊脂的制備

酶解羊脂：將新鮮羊脂與磷酸緩沖溶液以質(zhì)量比3∶2（pH 6.5）置于酶解罐中，并伴隨150 r/min機械攪拌，將脂肪酶以140 U/g底物加入溫度達到45 ℃體系中，酶解6 h，隨后將樣本在95 ℃條件下滅酶10 min，取出冷卻靜置分層，取上層羊脂置于-18 ℃保存?zhèn)溆茫ň幪枮镾2）。

氧化羊脂：將100 g羊脂置于250 mL四口燒瓶中，在95～100 ℃的油浴鍋中進行氧化，此過程伴隨150 r/min機械攪拌，空氣流速為60 L/h，反應(yīng)5 h后，立刻用冰水冷卻后置于-18 ℃保存?zhèn)溆?。S5為原料羊脂在上述方法下調(diào)溫度為130 ℃高溫氧化。S1為原料羊脂。

酶解-氧化羊脂樣本流程如下：

1.3.2 模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

5 種模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物編號分別為MRP1～MRP5。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物為0.5 gL-半胱氨酸、0.8 g葡萄糖、1.00 g羊脂混合于美拉德高溫反應(yīng)瓶中，加入20 mL 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖溶液，混合均勻后在120 ℃油浴鍋中反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后迅速置于冰浴中冷卻，待測。

1.3.3 不同處理方式羊脂及模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析

在15 mL樣品萃取瓶中，準確加入5.0 g羊脂（美拉德反應(yīng)產(chǎn)物取5 g），并加入10 μL 0.216 μg/mL的1,2-二氯苯甲醇溶液（美拉德樣品中加入2 μL質(zhì)量濃度為8.358 μg/mL的1,2-二氯苯甲醇溶液）作為內(nèi)標化合物，于55 ℃水浴中平衡5 min，再將老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中，同時推出纖維頭，頂空吸附30 min。吸附后，收回纖維頭并迅速移至GC進樣口，在250 ℃熱解吸7 min，同時啟動氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件：HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為He，流速1.2 mL/min；不分流進樣；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫到100 ℃，然后以12 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min；檢測器溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～450 u。

定性定量分析：將檢測到的揮發(fā)物數(shù)據(jù)與Willey 10、NIST 14數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果進行定性分析，采用以1,2-二氯苯為內(nèi)標的方法進行定量，具體方法參照相關(guān)文獻[12]。參考周文杰等[13]的方法計算各成分的氣味活度值（odor active value，OAV），并據(jù)此確定主要風(fēng)味物質(zhì)。

1.3.4 描述性感官評價

采用10 點制定量描述感官分析法對不同模式美拉德反應(yīng)體系進行評價，其中0代表沒有嗅到該香氣，9代表嗅到該香氣強度很強。感官評價小組由8 名（6 名女性和2 名男性，年齡21～40 歲）具有感官評價經(jīng)驗并熟悉模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的成員完成。使用6 種感官屬性為評價指標，即肉香味、羊肉味、脂香、逼真度、焦糊味和異味。為減少偏差，不同的模式美拉德反應(yīng)樣本以隨機三位數(shù)編碼后呈給評價人員在標準感官評價試驗室中完成，每個樣本平行評價3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以 ±s表示，數(shù)據(jù)分析用SPSS 25處理軟件。用Unscrambler version 9.7統(tǒng)計分析軟件分析5 種不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)及感官屬性，通過偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）法分析找出風(fēng)味物質(zhì)與感官屬性之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式羊脂揮發(fā)性物質(zhì)分析

利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜對5 種不同處理方式羊脂進行揮發(fā)性化合物檢測及定性定量分析。如表1所示，共鑒定出20 種揮發(fā)性化合物，包括14 種醛、1 種醇、2 種酮、2 種酸和1 種酚。不同處理方式羊脂在揮發(fā)性化合物的種類及含量中呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。S1、S2、S3、S4、S5分別檢出13、17、16、10、11 種揮發(fā)性化合物，且醛、酮、酸是5 種不同處理方式羊脂中主要的揮發(fā)性化合物。

表 1 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析不同處理方式羊脂揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile compounds identified in native and modified mutton tallow by SPME-GC-MS

羊脂氧化降解生成的揮發(fā)物中，醛類是其中最豐富的揮發(fā)性化合物。在14 種醛類中，庚醛、壬醛、正辛醛、2-十一烯醛、(Z)-6-壬烯醛在5 種羊脂中均被檢測出，與空白樣本S1相比，上述揮發(fā)物相對含量在其他處理方式羊脂中顯著降低（P＜0.05）。苯甲醛是一種芳香醛，通常用于食品，飲料等產(chǎn)業(yè)[14]，在空白樣本S1中未被檢出，卻在不同方式處理的羊脂中均被檢出，且其相對含量較高。癸醛、(2Z)-2-庚醛作為羊肉風(fēng)味主要的前體風(fēng)味化合物，在S1、S2、S3中被檢出，在S4及S5中未被檢出，這可能是由于羊脂在酶解及后續(xù)再氧化及高溫氧化過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他揮發(fā)性化合物或者喪失。此外，(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛僅在S5中被檢出，這與Song Shiqing等[15]的研究結(jié)果基本一致，其研究表明，(E,E)-2,4-庚二烯醛是牛肉風(fēng)味的特征前體揮發(fā)物，且脂肪在高溫140 ℃條件下氧化時，含量最高。

醇類風(fēng)味物質(zhì)與氨基酸代謝、脂肪降解、甲基酮還原和微生物繁殖密切相關(guān)，但醇類物質(zhì)閾值相較于醛酮化合物較高，因此其對羊肉風(fēng)味貢獻較小[16]。4-乙基環(huán)己醇在S1、S2和S3中檢測出，但未在S4及S5中檢測出，可能是醇在較高溫度下加熱氧化時，轉(zhuǎn)化為其他揮發(fā)性化合物或者喪失。

酮類化合物性質(zhì)穩(wěn)定，香氣持久，一般具有花香氣味，且能增強肉味[17]。如表1所示，檢出的仲辛酮和2-庚酮僅存在于S2和S3樣本中。有研究表明，酮通常在低溫（＜80 ℃）條件下產(chǎn)生[18]。仲辛酮被發(fā)現(xiàn)是新鮮香菇中的主要揮發(fā)性化合物[19]，2-庚酮與乳脂中的牛油和油膩味道有關(guān)[20]，是美拉德反應(yīng)重要的前體物質(zhì)。

2.2 不同處理方式羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜分析

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對5 組不同處理方式羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行揮發(fā)性物質(zhì)檢測及定性定量分析，結(jié)合OAV篩選得到對樣本有影響的氣味活性物質(zhì)，結(jié)果如表2、3所示。鑒定的“半胱氨酸-葡萄糖-羊脂”模式美拉德反應(yīng)體系生成的揮發(fā)物種類為35 種，其中包括醇（2 種）、醛（14 種）、酮（4 種）、酯（5 種）、噻吩（2 種）、呋喃（4 種）、酸（2 種）、苯（1 種）和酚（1 種）。5 種不同模式美拉德反應(yīng)體系共有的揮發(fā)物為壬醛、癸醛、硫代乙酸乙酯、2-乙酰基呋喃、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。

表 2 不同處理方式羊脂對模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Table 2 Effect of mutton tallow with different treatments on MRPs

表 3 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要成分OAVTable 3 Thresholds and OAVs of major components in different MRPs

由表2可知，醛類總相對含量在不同處理羊脂美拉德反應(yīng)體系中呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。醛在MRP5中檢出含量最多為（335.425±1.46）μg/kg，而在MRP4中最低，含量為（64.762±0.35）μg/kg。此外，醛對MRP5整體揮發(fā)物相對含量的貢獻率超過80%，在MRP1、MRP2、MRP3中的貢獻率超過40%，而在MRP4中貢獻率大約為22%，表明酶解-低溫氧化羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)生成了除醛以外的其他香氣物質(zhì)。正辛醛、壬醛、癸醛作為飽和直鏈醛，通常有令人不快的、辛辣的、尖刺的氣味并帶有油和蠟的特征氣味[21]，這3 種醛類在MRP1和MRP5中含量較高，推測可能是導(dǎo)致MRP1、MRP5整體感官屬性較差的部分原因。

醇類通常具有芳香、植物香、酸敗和土氣味，是脂肪自動氧化的產(chǎn)物。本實驗主要檢出2 種醇，即3,3-二甲基-1-丁醇及正庚醇，其含量在美拉德反應(yīng)體系MRP5中最高。正庚醇是鳙魚肉、可食用菌等的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[22-23]，推測正庚醇可能在MRP5的整體感官屬性中發(fā)揮作用。

酯類是由羥基脂肪酸的分子內(nèi)脫水產(chǎn)生的，是脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，其中一些與脂肪和果味特征呈正相關(guān)[24]。硫代乙酸乙酯在5 種模式美拉德反應(yīng)體系中都被檢出，且在MRP4中含量最高為（30.921±2.01）μg/kg，MRP1中最低為（5.693±0.40）μg/kg。硫代乙酸乙酯具有果香味、硫味和肉味，是水果中常見的一種酯類[25]。在羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)體系產(chǎn)物中被檢出，表明酯類的存在可能對美拉德反應(yīng)體系整體感官屬性具有修飾作用。

2-己基噻吩和2-庚基噻吩在MRP2和MRP4被檢測出，其含量較低且在2 個體系中無顯著差異（P＞0.05）。檢測出的含硫雜環(huán)類揮發(fā)物通常具有烤肉味，有研究表明其可能來自于含硫的氨基酸或者酰胺類物質(zhì)[26]。呋喃作為肉中主要的雜環(huán)類揮發(fā)物，對美拉德反應(yīng)體系的整體香氣具有重要作用。2-乙?；秽谒袠颖局卸紮z出，且MRP4中含量最高為（28.631±1.86）μg/kg。2-正戊基呋喃在MRP3和MRP4中被檢出，同時在MRP4 中含量最高為（20.207±1.31）μg/kg。具有豆香、果香的2-正戊基呋喃和具有焦糖、堅果香的2-乙?；秽贛RP4中含量最高[27]，主要原因可能是在酶水解過程中脂肪釋放出更多的磷脂和游離脂肪酸中的氨基，并且在羊脂降解過程中衍生出更多的熱解產(chǎn)物，導(dǎo)致美拉德反應(yīng)的不同途徑，從而生成更多的雜環(huán)類揮發(fā)物[28]。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價分析

圖 1 不同處理方式羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)感官評價賦值Fig. 1 Sensory attributes of different MRPs

如圖1所示，由不同羊脂為前體制備的MRP樣本之間在不同的感官屬性得分上均存在不同程度的差異（肉香味2.18、羊肉味1.84、脂香1.68、逼真度1.84、焦糊味0.27和異味1.38），說明不同處理方式的羊脂對產(chǎn)品感官特性影響較大。由圖1可以看出，原料羊脂制備的MRP1感官屬性整體偏低，卻呈現(xiàn)強烈的異味；而以高溫氧化羊脂為前體制備的MRP5在呈現(xiàn)明顯肉香味、羊肉味、脂香和高的逼真度的同時，其產(chǎn)品焦糊味亦明顯加劇，這可能主要歸因于羊脂在高溫氧化過程中產(chǎn)生的一些高濃度的脂質(zhì)過氧化物；與空白樣本MRP1相比，加入酶解羊脂和低溫氧化羊脂得到MRP2、MRP3樣本，其在焦糊味和異味不同程度上有所降低，同時在肉香味、羊肉味、脂香和逼真度上則明顯提升；與上述樣本相比，由酶解-低溫氧化羊脂制備的MRP4在整體感官屬性上較為均勻，尤其在肉香味、脂香和逼真度屬性上與高溫氧化羊脂制備的MRP5無明顯差異，且呈現(xiàn)出較弱的異味感和焦糊味。以上結(jié)果充分表明，單純通過酶解羊脂并不利于熱反應(yīng)產(chǎn)品各個感官風(fēng)味的呈現(xiàn)，結(jié)合低溫氧化處理不僅可達到高溫氧化羊脂同等呈味效應(yīng)，同時在一定程度上可避免或緩解脂肪高溫氧化對產(chǎn)品帶來的安全和品質(zhì)隱患。

2.4 不同處理方式羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物PLSR分析

采用ANOVA-PLSR研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性化合物和樣本及感官評價之間的相關(guān)性。以揮發(fā)性化合物為X軸，感官評價賦值及不同樣本為Y軸。PLSR模型呈現(xiàn)2 個顯著主成分，總解釋變量為72%。

如圖2所示，就第1主成分而言，MRP1及異味聚集于坐標軸的正相關(guān)區(qū)域，而其他美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及肉香味、羊肉味、脂香、逼真度位于坐標軸負相關(guān)區(qū)域，表明新鮮羊脂制備的樣本與不同處理方式羊脂制備的樣本差異顯著。除焦糊味外的其他感官屬性及大多數(shù)揮發(fā)性化合物都位于r2=0.5及r2=1之間，表明PLSR模型可以充分解釋上述變量。此外，MRP1和異味，MRP2與MRP3和脂香，MRP4與MRP5和肉香味、羊肉味、逼真度、焦糊味分別位于第4象限、第2象限和第3象限，表明位于同一象限的樣本與感官屬性的相關(guān)性較強，且焦糊味與MRP5的相關(guān)性比MRP4的相關(guān)性更強。

圖 2 不同處理方式羊脂制備的模式美拉德反應(yīng)揮發(fā)物及感官評價之間的PLSR分析載荷圖Fig. 2 Correlation loadings of PLSR for flavor compounds and sensory attributes of different MRPs

圖 3 揮發(fā)性化合物對感官屬性的顯著性影響分析Fig. 3 Estimated regression coefficients from PLSR prediction model showing significant correlations between volatile compounds and sensory attributes

為研究具體揮發(fā)性化合物對MRPs不同感官屬性的影響，利用PLS1進行實現(xiàn)。由圖3可知，揮發(fā)性化合物A14（(E)-2-辛烯醛）、A31（2-正戊基呋喃）、A34（壬酸）、A36（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）與肉香味具有顯著正相關(guān)，解釋變量為76%。揮發(fā)物A14（(E)-2-辛烯醛）、A24（鄰苯二甲酸丁酯）、A34（壬酸）、A36（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）與羊肉味有顯著正相關(guān)，解釋變量為53%。A12（2-十一烯醛）、A15（(Z)-6-壬烯醛）、A16（(E)-2-壬醛）、A34（壬酸）與脂香有關(guān)，解釋變量為60%。揮發(fā)性物質(zhì)A14（(E)-2-辛烯醛）、A24（鄰苯二甲酸丁酯）、A36（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）與逼真度有顯著正相關(guān)，其變量解釋率為54%。幾乎所有的物質(zhì)都與焦糊味無顯著正相關(guān)。A1（3,3-二甲基-1-丁醇）、A9（5-甲基-2-噻吩甲醛）、A21（5-甲基-2-己酮）、A28（2-庚基噻吩）和A32（2-辛基呋喃）與異味有顯著正相關(guān)，解釋變量為57%。

3 結(jié) 論

實驗采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合描述性感官評價對以原料羊脂和4 種不同處理方式（酶解、低溫氧化、酶解-低溫氧化、高溫氧化）羊脂為前體制備的模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)品風(fēng)味特性進行分析討論。結(jié)果表明，在熱反應(yīng)過程中羊脂處理方式對于熱反應(yīng)產(chǎn)物羊肉特征風(fēng)味呈現(xiàn)顯著差異。描述性感官評價結(jié)果表明通過由酶解-低溫氧化羊脂制備的MRP4在整體感官屬性上較為均勻，尤其在肉香味、脂香和逼真度，且呈現(xiàn)出較弱的異味感和焦糊味。進一步進行的PLSR分析，明確了感官屬性與各風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果表明，羊肉特征風(fēng)味揮發(fā)物可能與E-2-辛烯醛、2-正戊基呋喃、E-2-壬醛、2-庚基噻吩、5-甲基-2-噻吩甲醛、鄰苯二甲酸丁酯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚等有關(guān)，進一步確證了酶解-低溫氧化處理的羊脂是賦予熱加工體系羊肉風(fēng)味的最適前體。