姜黃素及其類似物抑制CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制研究

王子愷 毛泳彬 孔力

[摘要] 目的 研究姜黃素及其類似物抑制CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制。 方法 SD大鼠雄性40只，按體重隨機(jī)分成模型組，對(duì)照組，姜黃素組，H8低、高劑量組，每組8只。模型組，姜黃素組和H8組腹腔注射40%CCl4橄欖油復(fù)制肝纖維化模型，8周后姜黃素組，H8低、高劑量組給予相應(yīng)藥物灌胃，同時(shí)每周腹腔注射40%CCl4橄欖油一次，共4周。處死大鼠后，檢測(cè)血液生化指標(biāo)，肝組織HE和Masson染色觀察病理形態(tài)學(xué)變化，QPCR測(cè)Col1、纖連蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）mRNA。 結(jié)果 模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、肝臟系數(shù)、Col1、FN、TGF-β、α-SMA mRNA顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。姜黃素組，H8低、高劑量組血清ALT、AST、GGT、肝臟系數(shù)、Col1、FN、TGF-β、α-SMA mRNA顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 姜黃素及其類似物H8對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠有保護(hù)作用，且H8作用優(yōu)于姜黃素。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素及其類似物;四氯化碳;肝纖維化;肝臟系數(shù);病理形態(tài)學(xué)

[中圖分類號(hào)] R575.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（b）-0013-04

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of curcumin and its analogues on CCl4 induced hepatic fibrosis in rats. Methods Forty male Wistar rats were randomly divided into model， normal curcumin， H8 low and high dose groups， with 8 rats in each group according to body weight. The model group， curcumin group and H8 group were intraperitoneally injected with 40% CCl4 olive oil to replicate the liver fibrosis model. After 8 weeks， the curcumin group， H8 low and high dose groups were given the corresponding drugs by gavage， and intraperitoneal injection of 40% CCl4 olive oil once for 4 weeks. After sacrificed the rats， blood biochemical indicators were measured， pathological morphological changes were observed by HE and Masson staining of liver tissue， while Col1， fibronectin （FN）， transforming growth factor-β （TGF-β）， and α-smooth muscle actin （Α-SMA） mRNA were measured by QPCR. Results The alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， serum glutamyl transpeptidase （GGT）， liver coefficient， Col1， FN， TGF-β， α-SMA mRNA in the model group were significantly higher than those in the control group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. In the curcumin group， the serum ALT， AST， GGT， liver coefficient， Col1， FN， TGF-β， and α-SMA mRNA in the H8 low and high-dose groups were significantly lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Curcumin and its analogue H8 have therapeutic and protective effects on CCl4 induced liver fibrosis in rats， and H8 has better effects than curcumin.

[Key words] Curcumin and its analogues; Carbon tetrachloride; Liver fibrosis; Liver coefficient; Pathomorphology

姜黃素（Curcumin）具有抗炎、抗癌、抗肝纖維化等藥理作用[1-3]，抗癌作用已二期臨床[4-5]。但姜黃素溶解度差，血藥濃度低，限制了應(yīng)用[6]。課題組以姜黃素為母體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成穩(wěn)定的姜黃素類似物[7-8]。本文探討H8對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)SD大鼠[遼寧長(zhǎng)生生物，SCXK（遼）2015-0001，合格號(hào)：211002300036102]，雄性，體重300～400 g。于18～24℃、濕度50%～70%、12 h交替照明環(huán)境下，自由飲食。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑與儀器H8（牡丹江醫(yī)學(xué)院設(shè)計(jì)）;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen，貨號(hào)：11904018）;伊紅、蘇木精（北京索萊寶科技）;Col1（GR3265108-1）、FN（GR3274504-1）、TGF-β（GR 3203762-3）、α-SMA（GR 3263275-5）抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam;激光共聚焦顯微鏡（FV1000日本Olympus）;凝膠成像分析系統(tǒng)（FluorChem M美國(guó)）;熒光定量PCR儀（StepOne美國(guó)ABI）。

1.2 方法

SD大鼠40只，按體重隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、姜黃素組（姜黃素5 mg/kg），H8低、高劑量組（H8 5、10 mg/kg）。對(duì)照組腹腔注射1.2 mL/kg橄欖油，2次/周×8周;其余4組按2 mL/kg的40%CCl4橄欖油腹腔注射，2次/周×8周。治療組用1%CMC溶解姜黃素（5 mg/kg），H8（5、10 mg/kg），1次/d×28 d，模型組和對(duì)照組給予空白溶劑灌胃。

1.3 標(biāo)本采集測(cè)定

12周后，禁食24 h，乙醚麻醉后處死大鼠。心臟取血，37℃孵育30 min，3000 × g離心15 min，生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清中谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）。肝臟重量除于體重得肝臟系數(shù)。部分肝組織用4%甲醛固定，其他放入-80℃冰箱中。

1.4 病理學(xué)檢測(cè)

HE染色觀察病理變化，Masson染色觀察纖維化變化。HE染色：取甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，切片5 μm，烘干、二甲苯，梯度酒精脫水，伊紅-蘇木精染色，在顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理變化。Masson染色：同上切片，Masson試劑盒染色，在顯微鏡下觀察肝組織纖維化。

1.5 肝組織中纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL cDNA，9 μL SYBR Green Mix，分別加Col1、纖連蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、內(nèi)參RPS16上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。QPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)2個(gè)復(fù)孔，測(cè)Ct值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。引物：Col1正義3′-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-5′，反義3′-GCCAGGAGAACCAGCAGA-GC-5′;TGF-β正義3′-CAACAATTCCTGGCGTTACCTTG-5′，反義3′-CGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-5′;α-SMA正義3′-CACCATCGGGAATGAACGCTTC-5′，反義3′-CTGTCAGCAATGCCTGGGTA-5′;FN正義3′-GCCTGAACCAGCCTACGGAT-5′，反義ATGACC-ACTGCCAAAGCCCAAG-5′;RPS16正義3′-CGTG-CTTGTGCTCGGAGCTA-5′，反義3′-GCTCCTTGCCC-AGAAGCAAA-5′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 5.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間采用One-way AVONA單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢查。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST和GGT及肝臟系數(shù)比較

模型組血清ALT、AST和GGT顯著高于對(duì)照組;姜黃素組，H8低、高劑量組血清ALT、AST和GGT水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。模型組肝臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組;姜黃素組，H8低、高劑量組肝臟系數(shù)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉排列不規(guī)則，肝竇高度擴(kuò)增，間質(zhì)內(nèi)有炎性浸潤(rùn)。與模型組比較，姜黃素組，H8低、高劑量組肝索排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝竇變窄，鮮見(jiàn)肝細(xì)胞變性和炎性浸潤(rùn)。HE染色見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，模型組肝組織出現(xiàn)廣泛纖維化。與模型組比較，姜黃素組大鼠纖維化減輕，H8低、高劑量組纖維化降低更明顯。Masson染色見(jiàn)圖2。

2.3 H8對(duì)大鼠肝纖維化基因的影響

模型組Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;姜黃素組，H8低、高劑量Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖3。

3 討論

CCl4是經(jīng)典肝纖維化模型的誘導(dǎo)劑，被機(jī)體吸收后被細(xì)胞色素氧化酶P450激活為CCl3和Cl自由基[9]，與生物大分子結(jié)合，肝細(xì)胞壞死和膠原沉積，導(dǎo)致肝纖維化[10]，可作為肝纖維化模型[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，肝纖維化動(dòng)物血清中肝臟系數(shù)、ALT、AST、GGT增加[12-13]，并且Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達(dá)增多[14-15]。本實(shí)驗(yàn)在CCl4造模后，指標(biāo)與相關(guān)文獻(xiàn)一致。經(jīng)過(guò)治療這些指標(biāo)均降低，提示姜黃素及H8能改善CCl4所致大鼠肝臟纖維化，其中H8效果更明顯，具有應(yīng)用前景[8]。

肝纖維化是復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其特征為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增多，肝臟結(jié)構(gòu)破壞，肝功能下降[16]。正常肝星狀細(xì)胞（HSCs）維持靜止表型[17]，隨著HSC活化和增殖，增加ECM相關(guān)蛋白α-SMA、Col1[18]。TGF-β/Smads信號(hào)通路激活，加快ECM生成與沉積[19-20]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MCol1、TGF-β、α-SMA、FN增高，經(jīng)治療后又被抑制，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)一致[15]。

綜上，姜黃素及其類似物H8可抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，機(jī)制與減少ECM相關(guān)蛋白有關(guān)，為開(kāi)發(fā)保護(hù)肝臟纖維化的藥物奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-08-28? 本文編輯：王曉曄）