基于SSR標(biāo)記的油桃品種需冷性分析

史芳芳 梁武軍 張延磊

摘要?[目的]利用已發(fā)表的桃SSR引物分析桃品種資源圃油桃遺傳多樣性，以期為油桃育種和反季節(jié)栽培研究提供參考。[方法]利用24對(duì)SSR引物分別對(duì)27個(gè)油桃品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物對(duì)27個(gè)油桃品種進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，并采用遺傳相似系數(shù)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。[結(jié)果]從合成的24對(duì)SSR引物中篩選出5對(duì)條帶清晰、具有多態(tài)性的引物，利用聚類(lèi)分析軟件，將油桃分成兩大類(lèi)，第一大類(lèi)包括23個(gè)栽培種，其遺傳系數(shù)在0.9以上，第二大類(lèi)包括4個(gè)原始種，其遺傳系數(shù)在0.75～0.85，同時(shí)鑒別出2個(gè)同物異名的栽培種質(zhì)資源。[結(jié)論]基于文獻(xiàn)中發(fā)表的SSR桃引物篩選出多態(tài)性較好的引物可用于油桃SSR分析。毛細(xì)管電泳可以將擴(kuò)增條帶分離至1?bp，能更好地區(qū)分種內(nèi)差異。27個(gè)油桃品種有2個(gè)原始品種，即臺(tái)農(nóng)甜蜜和黑油皇后，與23個(gè)栽培品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以作為母本進(jìn)行雜交育種，且可以作為需冷性品種候選種質(zhì)。

關(guān)鍵詞?油桃;SSR;親緣關(guān)系;種質(zhì)資源

中圖分類(lèi)號(hào)?S662.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0059-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.019

SSR?Analysis?on?Required?Cooling?of?Nectarin?Cultivated?Varieties

SHI?Fangfang，?LIANG?Wujun，ZHANG?Yanlei

（Institute?of?Agricultural?Sciences?of?the?12th?Division?of?Xinjiang?Production?and?Construction?Corps，?Urumqi，Xinjiang??830088）

Abstract?[Objective]?To?provide?reference?for?nectarine?breeding?and?offseason?cultivation，the?genetic?diversity?of?nectarine?in?peach?variety?resource?nursery?was?analyzed?by?using?published?peach?SSR?primers.?[Method]?27?nectarine?varieties?were?amplified?by?PCR?with?24?pairs?of?SSR?primers.?27?nectarine?varieties?were?analyzed?by?capillary?electrophoresis?with?the?good?polymorphism?and?high?stability?primers，?and?the?amplification?results?were?analyzed?by?genetic?similarity?coefficient.[Result]?Five?pairs?of?primers?with?clear?bands?and?polymorphism?were?selected?from?24?pairs?of?SSR?primers.Nectarine?was?divided?into?two?categories，?the?first?of?which?included?23?cultivated?species，in?which?the?genetic?coefficient?of?cultivated?species?was?above?0.9.The?second?group?consisted?of?4?original?species，that?of?original?species?was?between?075?and?0.85，meanwhile?it?could?clearly?identify?the?synonyms?of?two?germplasm?resources.[Conclusion]?Based?on?the?SSR?peach?primers?published?in?the?literature，?the?primers?with?good?polymorphism?could?be?used?for?SSR?analysis?of?nectarine.?Capillary?electrophoresis?could?isolate?the?amplified?bands?to?1bp.?There?were?two?original?species?of?27?nectarine?varieties，?namely?Tainong?sweet?and?black?oil?queen，?which?were?not?closely?related?to?23?cultivated?varieties?and?could?be?used?as?female?parents?to?cross?breeding，and?can?be?used?as?a?candidate?germplasm?for?required?cooling?research.

Key?words?Nectarine;SSR;Genetic?relationship;Germplasm?resources

基金項(xiàng)目?十二師農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目“果樹(shù)種質(zhì)資源引種與省力高效標(biāo)準(zhǔn)化栽培示范”（SR2016024）;十二師農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目“盆栽桃規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（SR2017015）。

作者簡(jiǎn)介?史芳芳（1977—），女，山東濰坊人，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，從事農(nóng)作物育種及農(nóng)業(yè)科研推廣工作。通信作者，高級(jí)農(nóng)藝師，從事農(nóng)業(yè)科研推廣工作。

收稿日期?2019-09-04

目前，很多基層科研單位在開(kāi)展桃品種的引種篩選試驗(yàn)研究，一方面進(jìn)行品種適應(yīng)性觀察試驗(yàn)，另一方面為今后開(kāi)展桃品種雜交試驗(yàn)提供較為豐富的種質(zhì)，但多數(shù)單位僅從果實(shí)性狀調(diào)查、植株長(zhǎng)勢(shì)等農(nóng)藝性狀方面進(jìn)行判斷，或從形態(tài)學(xué)方面對(duì)品種進(jìn)行分類(lèi)，因此對(duì)于一些種間的雜種進(jìn)行歸類(lèi)十分困難[1]，致使調(diào)查、評(píng)價(jià)篩選不足[2]。隨著研究水平的深入，對(duì)種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)已上升到分子水平[3]，調(diào)查本區(qū)域內(nèi)資源圃中油桃的親緣關(guān)系對(duì)種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)及今后開(kāi)展育種工作具有重要意義。桃種質(zhì)資源收集、利用、評(píng)價(jià)是桃育種創(chuàng)新的基礎(chǔ)[4]。桃的種質(zhì)資源分析多集中在對(duì)本地區(qū)內(nèi)的桃品種進(jìn)行遺傳評(píng)價(jià)[5-6]，而對(duì)具有豐富地域性的引進(jìn)品種進(jìn)行遺傳分析的較少。筆者利用已公布的SSR分子標(biāo)記，對(duì)收集保存于新疆第十二師農(nóng)科所果樹(shù)資源圃，來(lái)源于全國(guó)南北方各地品種或品系27份油桃種質(zhì)，包括栽培品種（系）、原始種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，從DNA水平評(píng)估遺傳多樣性，并進(jìn)一步探究引進(jìn)的原始種質(zhì)與栽培品種間的親緣關(guān)系，為今后的遺傳育種提供可靠的遺傳背景信息。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

油桃種質(zhì)資源共27份，均來(lái)自于新疆兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所桃資源圃，包括原始種和栽培種。供試材料信息見(jiàn)表1。

1.2?SSR擴(kuò)增

利用上海生工工程有限公司植物提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，從已發(fā)表的SSR引物[7-10]中篩選出能在27份樣本間穩(wěn)定擴(kuò)增、多態(tài)性好的5對(duì)薔薇類(lèi)SSR引物（表2）用于遺傳分析。反應(yīng)體系20?μL，擴(kuò)增程序：94?℃預(yù)變性3?min，94?℃預(yù)變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，30次循環(huán);72?℃延伸10?min;4?℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，加入微量上樣緩沖液混勻，5?μL擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，150?V穩(wěn)壓電泳20?min。電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)紫外成像觀察擴(kuò)增效果和多態(tài)性。將擴(kuò)增產(chǎn)物寄到杭州奧盛儀器有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳SSR分析。

1.3?統(tǒng)計(jì)分析

選取擴(kuò)增清晰的條帶，在相同遷移位置，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，不同引物擴(kuò)增的結(jié)果構(gòu)成原始的“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣。將矩陣用NTSYSPC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相似性數(shù)據(jù)采用Dice系數(shù)，選用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?SSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性引物篩選

將供試的27份油桃品種或品系用不同的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳后以條帶多態(tài)性為標(biāo)準(zhǔn)，從合成的24對(duì)SSR引物中篩選出5對(duì)條帶清晰、具有多態(tài)性的引物（表2）。這些引物共擴(kuò)增出

54條DNA片段，具有多態(tài)性片段15條，占比28%，平均每個(gè)引物11.2條，最多15條，最少7條，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多數(shù)集中在100～300?bp，圖1為引物CPPCT002擴(kuò)增的情況，小于100?bp條帶不計(jì)作有效帶，因此，此引物有效擴(kuò)增條帶為5條，即141、127、135、156、163?bp。

2.2?遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析?依據(jù)聚類(lèi)分析。27份油桃種質(zhì)可劃分為2個(gè)類(lèi)群（圖2），23個(gè)品種（系）歸為第一大類(lèi)，屬于栽培種，遺傳距離在0.9以上，其中，鄭4-24與旭日遺傳距離為0，相似系數(shù)為1，可能是品種的地區(qū)交叉?zhèn)鞑ギa(chǎn)生的同物異名現(xiàn)象。其余4個(gè)品種（系）歸為第二大類(lèi)，屬于原始品種，在遺傳距離為0.87處，金海霞與短枝油桃聚在一起，0.77處臺(tái)農(nóng)甜蜜單獨(dú)一類(lèi)，0.75處黑油皇后也單獨(dú)一類(lèi)?？傮w聚類(lèi)表明，栽培品種間存在較低的遺傳變異，遺傳背景相近。原始品種遺傳變異較栽培種高，遺傳背景與栽培種較遠(yuǎn)，其中，地方品種黑油皇后與其他栽培種品種遺傳距離最遠(yuǎn)。

從相似性矩陣（圖3）可以看出，黑油皇后與其他品種相似系數(shù)在0.59～0.81，臺(tái)農(nóng)甜蜜相似系數(shù)在0.59～083，短枝油桃相似系數(shù)在0.66～0.87，金海霞相似系數(shù)在0.72～090。結(jié)合聚類(lèi)分析結(jié)果，黑油皇后可作為資源圃中與其他栽培種油桃雜交的最佳母本。

3?討論

3.1?SSR技術(shù)中應(yīng)用毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)

SSR技術(shù)已被廣泛用于物種親緣關(guān)系分析，但目前，很多科研單位和大學(xué)為了節(jié)約成本或者大規(guī)模進(jìn)行SSR篩選試驗(yàn)仍在使用瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺電泳，二者的分辨率很低，特別是瓊脂糖凝膠電泳只能進(jìn)行初篩，而且聚丙烯酰胺電泳試劑配制過(guò)程復(fù)雜，電泳時(shí)間長(zhǎng)，需要染色、脫色等步驟，即便跑出條帶，有時(shí)會(huì)因?yàn)槟硞€(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，導(dǎo)致最終電泳條帶顯示不明顯，或者沒(méi)有拉開(kāi)條帶距離，不能將差異大小小于10?bp的基因片段分離開(kāi)，條帶特異性表現(xiàn)不充分。

毛細(xì)管電泳原理基于微流體技術(shù)，分辨率可以達(dá)到?1?bp。與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳相比，毛細(xì)管電泳所需樣品量低于1?μL，檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到?5?pg/μL，樣品分析時(shí)間可短至幾十秒，而且分離檢測(cè)過(guò)程全部由儀器自動(dòng)來(lái)完成，無(wú)人工介入，無(wú)交叉污染。與傳統(tǒng)電泳相比，毛細(xì)管電泳可用的引物范圍較廣，適用于絕大多數(shù)SSR引物，因此試驗(yàn)成本更經(jīng)濟(jì)。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳根據(jù)峰值獲得的數(shù)值化數(shù)據(jù)更精確，后期數(shù)據(jù)分析更簡(jiǎn)便，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，且通量高，全程無(wú)毒無(wú)害[11]。

該研究選用桃資源圃27份油桃資源作為試驗(yàn)材料，采用?SSR?分析技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，篩選出適用于鑒定該試驗(yàn)的油桃SSR引物5對(duì)，建立了一套簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的油桃品種（品系）親緣關(guān)系鑒定方法，為完善桃品種快速鑒定方法提供參考。

3.2?需冷量不同油桃篩選

新疆冬季時(shí)間比較漫長(zhǎng)，種植的桃樹(shù)一般開(kāi)花期和結(jié)果期均較內(nèi)地晚，桃樹(shù)需冷量較高，但目前已有科研單位研究通過(guò)引進(jìn)需冷量低的設(shè)施品種進(jìn)行反季節(jié)栽培，達(dá)到提早上市。基于此，通過(guò)油桃SSR分析，結(jié)合物候期觀察試圖將低需冷量油桃品種（品系）與較高需冷量油桃品種（品系）分離開(kāi)，便于篩選出適合于設(shè)施反季節(jié)栽培品種，并為今后開(kāi)展桃品種雜交育種試驗(yàn)提供參考。該研究將已知需冷量低的品種臺(tái)農(nóng)甜蜜作為目標(biāo)篩選品種，通過(guò)SSR分子標(biāo)記分析，篩選出與臺(tái)農(nóng)甜蜜遺傳系數(shù)接近的品種（品系）作為需冷量低的候選品種（品系），后期對(duì)初篩品種重點(diǎn)開(kāi)展物候期觀察，最終確定反季節(jié)栽培品種。該研究結(jié)果表明黑油皇后、短枝油桃和金海霞品種與臺(tái)農(nóng)甜蜜遺傳系數(shù)更為接近，可以作為今后研究重點(diǎn)。

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