雒曉芳　許淑娟　陳麗華　王冬梅　張璐　費(fèi)孝桐　趙梓彤

摘要：目的??分離鑒定鐵皮石斛的內(nèi)生真菌，為鐵皮石斛的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。方法??以多種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)分離培養(yǎng)基，分別從鐵皮石斛的根、莖和葉中分離內(nèi)生真菌，采用平板劃線法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行純化，并觀察其菌落形態(tài)。利用形態(tài)學(xué)、生理生化分子特性及分子生物學(xué)手段鑒定內(nèi)生真菌。結(jié)果??分離得到7株鐵皮石斛內(nèi)生真菌，根、莖和葉中的真菌種類和數(shù)量各不相同，僅X1菌株同時(shí)存在于根、莖和葉部位。通過(guò)對(duì)性狀穩(wěn)定的3株真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，XJ1與鏈格孢菌Alternaria?sp.的16S?rDNA序列有99%的同源性，XY6與鏈格孢菌Alternaria?sp.的16S?rDNA序列有93%的同源性，X1菌株與好食鏈孢霉菌Neurospora?africana的16S?rDNA序列有99%的同源性。結(jié)論??本研究分離并鑒定了鐵皮石斛根、莖和葉中的內(nèi)生真菌，可為鐵皮石斛資源的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;內(nèi)生真菌;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：R284.1????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????文章編號(hào)：1005-5304（2020）03-0057-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201810125

Isolation?and?Identification?of?Endophytic?Fungi?in?Roots，?Stems?and?Leaves?of?Dendrobium?officinale

LUO?Xiaofang1，?XU?Shujuan2，?CHEN?Lihua3，?WANG?Dongmei1，?ZHANG?Lu1，?FEI?Xiaotong2，?ZHAO?Zitong2

1.?Center?of?Experiment，?Northwest?Minzu?University，?Lanzhou?730030，?China;

2.?College?of?Life?Science?and?Engineering，?Northwest?Minzu?University，?Lanzhou?730030，?China;

3.?School?of?Chemical?Engineering，?Northwest?Minzu?University，?Lanzhou?730030，?China

Abstract：?Objective?To?isolate?and?identify?the?endophytic?fungi?in?different?tissues?of?Dendrobium?officinale;?To?provide?basis?for?development?and?utilization?of?Dendrobium?officinale.?Methods?The?endophytic?fungi?was?isolated?from?the?roots，?stems?and?leaves?of?Dendrobium?officinale?by?using?various?basal?culture?media.?The?isolated?strains?were?purified?by?the?plate?streaking，?and?their?colony?morphology?was?observed.?Endophytic?fungi?were?identified?by?morphological，?physiological?and?biochemical?molecular?characteristics?and?molecular?biological?methods.?Results?Seven?strains?of?endophytic?fungi?were?isolated.?The?quantity?and?species?of?microorganisms?differed?in?roots，?stems?and?leaves.?Only?X1?existed?in?roots，?stems?and?leaves?at?the?same?time.?Three?strains?of?fungi?with?stable?characters?were?identified?by?molecular?biology.?By?molecular?bioassay?of?three?fungi?with?stable?traits，?XJ1?had?99%?homology?with?the?16S?rDNA?sequence?of?Alternaria?sp.;?XY6?had?93%?homology?with?the?16S?rDNA?sequence?of?Alternaria?sp.;?X1?strain?had?99%?homology?with?the?16S?rDNA?sequence?of?Neurospora?africana.?Conclusion?This?study?isolates?and?identifies?endophytic?fungi?from?the?roots，?stems?and?leaves?of?Dendrobium?officinale，?which?can?provide?a?basis?for?the?development?and?utilization?of?Dendrobium?officinale?resources.

Keywords：?Dendrobium?officinale;?endophytic?fungi;?isolation;?identification

鐵皮石斛Dendrobium?officinale為蘭科石斛屬多年生草本植物，不僅是傳統(tǒng)的珍貴中藥材，也具有很高的觀賞價(jià)值。鐵皮石斛廣泛分布于安徽、浙江、云南、廣西、廣東等地，其生長(zhǎng)緩慢，自身繁殖力低，需要與內(nèi)生菌共生才能完成生活史。

微生物與植物體相互作用關(guān)系由來(lái)已久，大多數(shù)植物體的根、莖、葉都分布著數(shù)量和種類眾多的微生物[1]。微生物與植物體的相互作用對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，對(duì)植物具有多方面的積極作用。在生物防治上，植物內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體內(nèi)，有充分的碳源和氮源的供應(yīng)，比暴露于外界的惡劣環(huán)境中更有利于發(fā)揮作用[2]。

鐵皮石斛含有多種內(nèi)生真菌，一些內(nèi)生真菌能有效促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，并在組織和宿主中表現(xiàn)出一定的差異[3]。鐵皮石斛內(nèi)生真菌是篩選新活性物質(zhì)的重要資源[4-10]。本試驗(yàn)以鐵皮石斛根、莖和葉為試驗(yàn)材料，分離鐵皮石斛不同部位的菌株，對(duì)其進(jìn)行比較鑒別，為鐵皮石斛的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1??材料

在云南省普洱市寧洱縣五里坡選取生長(zhǎng)優(yōu)良、表面無(wú)病蟲(chóng)害的仿野生生長(zhǎng)3年以上的鐵皮石斛整個(gè)植株，經(jīng)西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院郭鵬輝鑒定為鐵皮石斛Dendrobium?officinale。

培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物有限責(zé)任公司，批號(hào)20180706-00。①麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：氯霉素0.1?g，麥芽膏粉30?g，瓊脂15?g，加水定容至1?L，121?℃高壓滅菌30?min。②馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基：土豆沖洗干凈并去皮，取200?g切成小塊，加入純水1?L，煮沸30?min，補(bǔ)純水至1?L。在濾液中加入10?g瓊脂，煮沸后加入20?g糖，溶解，補(bǔ)水，121?℃滅菌30?min。③高鹽察氏培養(yǎng)基：氯化鉀0.5?g，硫酸亞鐵0.01?g，氯化鈉60?g，蔗糖30?g，瓊脂20?g，加水定容至1?L，121?℃高壓滅菌30?min。④營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏1?g，酵母膏2?g，蛋白胨5?g，NaCl?5?g，瓊脂15?g，加水定容至1?L，調(diào)pH值為7.4，加熱溶解，121?℃高壓滅菌30?min。⑤LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10?g，酵母提取物5?g，NaCl?5?g，瓊脂粉15?g，加水定容至1?L，調(diào)pH值至7.4，加熱溶解，121?℃高壓滅菌30?min。

鹽酸、蔗糖、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、異丙醇、10%SDS、雙氧水、1×TAE（pH?8.0）、1%氯化汞、亞硫酸鈉、硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀、10?mg/mL?Rnase（Sigma）、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液、5%石炭酸復(fù)紅染色液。

2??方法與結(jié)果

2.1??菌種篩選

2.1.1??初篩

選取新鮮健康鐵皮石斛植株的根段、莖段和葉片，用流水沖洗干凈，去除表面雜土顆粒后帶入無(wú)菌操作臺(tái)中，用75%酒精表面消毒20?s，無(wú)菌水沖洗3次，0.1%氯化汞浸泡消毒3～5?min，再用無(wú)菌水浸洗4次。濾干后將樣品置于培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌刀片將其切成2～3?mm薄片，棄去兩頭切片，選取中間切片，按照插片法將切片等距離均勻分別放置于含鏈霉素（50～100?mg/L）和青霉素（100～300?mg/L）的5種固體培養(yǎng)基（麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基）上，3～4片/皿。于26?℃黑暗條件下培養(yǎng)5～10?d，待切片周圍長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落時(shí)，以平板劃線法用接種環(huán)立即挑取單個(gè)菌落移入另一個(gè)平板上，四區(qū)劃線分離真菌，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.1.2??復(fù)篩

將初篩獲得的優(yōu)勢(shì)菌種用平板劃線法進(jìn)行純化分離，連續(xù)富集培養(yǎng)3次。當(dāng)富集培養(yǎng)均無(wú)雜菌出現(xiàn)，用平板劃線法進(jìn)行菌株的分離純化，重復(fù)3次。肉眼觀察培養(yǎng)特征，選擇生長(zhǎng)優(yōu)良的菌株。將得到的單菌株接種到斜面上，26?℃培養(yǎng)3～5?d，置于4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2??菌種鑒定

2.2.1??形態(tài)學(xué)鑒定

用5種不同的固體及對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基經(jīng)初篩、富集培養(yǎng)及分離純化，從葉中分離出5株真菌，從莖中分離出2株真菌，從根中分離出2株真菌，共得到7株鐵皮石斛優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，分別編號(hào)為XY6、XY4、XY1、XY5、XJ1、XG2、X1。菌落形態(tài)見(jiàn)圖1、表1。將純化的菌株用0.5%石炭酸復(fù)紅染色液或乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液簡(jiǎn)單染色后觀察形態(tài)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

XY6菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上26?℃培養(yǎng)4?d即形成較典型的菌落，菌落整體較為平坦，中心有臍狀突起，而其他部分有少量放射狀短紋，邊緣明確、整齊，質(zhì)地絨狀，分生孢子面淡褐色;菌絲體為白色，具隔膜。石炭酸復(fù)紅染色后孢子著色較深，僅觀察到分生孢子為棒狀，孢子上有環(huán)痕，判斷分生孢子為環(huán)痕孢子。根據(jù)XY6菌株的培養(yǎng)特征及染色后顯微鏡下形態(tài)觀察，借助《真菌鑒定手冊(cè)》[11]及《中國(guó)真菌志》[12]對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，確定該菌株應(yīng)為半知菌類、絲孢綱、叢梗孢目、暗叢梗孢科某真菌。

XJ1菌落在高鹽察氏培養(yǎng)基上28?℃培養(yǎng)7?d即形成較典型的菌落，中心有突起，質(zhì)地絨狀，邊緣不整齊，邊緣的菌絲體白色，中部呈綠色，反面暗綠色。根據(jù)XJ1菌株的培養(yǎng)特征及石炭酸復(fù)紅染液染色后顯微鏡下形態(tài)觀察，借助《真菌鑒定手冊(cè)》[11]及《中國(guó)真菌志》[12]，初步鑒定該菌為叢梗孢科某真菌。

X1菌落在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上28?℃培養(yǎng)3?d即形成較典型的菌落，菌落呈白色、蛛網(wǎng)狀，無(wú)隔。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝為雙輪生或三輪生，?；枯?～3個(gè)，瓶梗每輪4～8個(gè)，分生孢子為橢圓形，壁平滑，分生孢子鏈圓柱狀。根據(jù)X1菌株的培養(yǎng)特征及乳酸石炭酸棉藍(lán)染液染色后顯微鏡下形態(tài)觀察，借助《真菌鑒定手冊(cè)》[11]及《中國(guó)真菌志》[12]，初步鑒定該菌為叢梗孢科某真菌。

2.2.2??進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)16sRNA-ITS測(cè)序，將3株優(yōu)勢(shì)菌株XY6、XJ1、X1的16S?rDNA核酸序列輸入NCBI?Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），與已知的菌株序列進(jìn)行比對(duì)，分析其親緣和進(jìn)化關(guān)系，并用MEGA5.1軟件繪制菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3～圖6。結(jié)果表明，XJ1與鏈格孢菌Alternaria?sp.的16S?rDNA序列有99%的同源性，XY6與鏈格孢菌Alternaria?sp.的16S?rDNA序列有93%，X1菌株與好食鏈孢霉菌Neurospora?africana的16S?rDNA序列有99%的同源性。結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)染色結(jié)果綜合分析，將XJ1與XY6菌株均歸屬于鏈格孢菌屬Alternaria?sp.，X1與好食鏈孢霉菌Neurospora?africana具有較近的遺傳距離。

3??討論

內(nèi)生真菌指長(zhǎng)期生活在植物根、莖、葉等器官的組織內(nèi)部，但一般不引發(fā)植物體病害的真菌[13-14]。本試驗(yàn)從健康生長(zhǎng)的鐵皮石斛植株根、莖和葉中分離得到7株內(nèi)生真菌，并對(duì)其中3株具有代表性的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)16sRNA-ITS測(cè)序和比對(duì)，得到X1、XJ1和XY6菌株同為鏈格孢菌屬，其中X1為鏈孢霉屬中的好食鏈孢霉菌種。鏈格孢菌屬為真菌界半知菌綱鏈孢霉目黑霉科，廣泛分布于自然界土壤及禾本植物。大多數(shù)此類菌種兼性寄生在植物上，少數(shù)幾個(gè)鏈格孢小孢子種可侵染人和動(dòng)物。此外，鏈格孢菌是一種具有應(yīng)用潛力的生物資源，如長(zhǎng)柄鏈格孢某些菌株分生孢子壁中含有激發(fā)子組份，可被用來(lái)制成防治煙草赤星病的生防制劑等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，鏈孢霉菌絲體中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖分、淀粉、酶及多種維生素乙等營(yíng)養(yǎng)成分，這種霉菌在飼料中大量繁殖，可提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使粗飼料成為精飼料[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)，X1內(nèi)生真菌可產(chǎn)生橙紅色色素，我們將對(duì)其穩(wěn)定性及相關(guān)抑菌活性進(jìn)行研究[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)菌、真菌等微生物產(chǎn)生的色素可以作為天然染料用于紡織品的染色，可選擇能夠大量生產(chǎn)色素的真菌作為新型的天然染料應(yīng)用于紡織品染色，利用真菌培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)對(duì)色素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[19-21]。本研究可為鐵皮石斛內(nèi)生真菌的生物活性物質(zhì)篩選和鐵皮石斛資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-10-13）

（修回日期：2019-04-10;編輯：陳靜）