劉瑋，徐曉飛，任杰，楊繼國(guó),2*

1(華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞，523808)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510641)

霉菌毒素是霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已知的有400余種，主要由曲霉屬、鐮孢屬和青霉屬真菌產(chǎn)生[1]。對(duì)人和動(dòng)物危害較大的有黃曲霉毒素(Aflatoxin)、赭曲霉毒素(Ochratoxin)、伏馬毒素(Fumonisin)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)和單端孢霉烯毒素(Trichothecene)等幾類，主要表現(xiàn)在肝臟毒性、腎臟毒性、致癌性、致畸性、致突變和免疫抑制等方面[2-3]。

霉菌毒素對(duì)農(nóng)作物污染范圍廣且不容易在收獲前有效清除[4]，因而研究脫除霉菌毒素的方法十分必要。目前對(duì)脫除霉菌毒素的研究，主要分為物理法、化學(xué)法和生物法。物理法常用的手段是清洗、吸附、輻射和熱處理，比較新穎的方式有電解水處理、脈沖光束和冷等離子體處理[5]，但這些方法對(duì)設(shè)備要求高，能源消耗大，脫毒過程會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分造成破壞，一般只適合霉變程度輕且顆粒大的物料?；瘜W(xué)法可分為酸、堿處理、氨處理以及強(qiáng)氧化劑處理，利用霉菌毒素在強(qiáng)酸強(qiáng)堿或者氧化環(huán)境中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，將之破壞，但化學(xué)反應(yīng)降解毒素容易產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，且化學(xué)試劑殘留會(huì)造成二次污染[6]。不同于物理和化學(xué)脫毒法，生物法利用各種微生物脫除霉菌毒素，具有反應(yīng)條件溫和、脫毒能耗小、環(huán)境友好、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞少、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7]。

1 生物脫毒

1.1 生物吸附脫毒

微生物或微生物材料與毒素結(jié)合形成吸附復(fù)合物，再由過濾等方式除去，通常適合于液體物料或者溶液體系。

HASKARD等[8]研究了乳酸菌與黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)在培養(yǎng)基中的結(jié)合效果，證明毒素可以被乳酸菌吸附，在4～37 ℃ 和pH 2～10范圍內(nèi)沒有明顯的解吸現(xiàn)象，但所形成的結(jié)合仍是可逆的。此后陸續(xù)有報(bào)道利用乳酸菌除去小麥中的脫氧雪腐烯醇(deoxynivalenol, DON)、T-2和HT-2等毒素[9]，在食品發(fā)酵過程中結(jié)合伏馬毒素B1和B2(fumonisin B1, FB1、fumonisin B2, FB2)，并降低其生物利用度和毒性[10]；也可以在牛奶中吸附結(jié)合黃曲霉毒素M1(AFM1)[11]，吸附效果在34.0%～78.9%范圍內(nèi)不等(表1)。研究也證明酵母可以吸附玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)和AFB1、AFM1等多種毒素[12]。CHLEBICZ等[13]研究了12種乳酸菌和6種酵母對(duì)霉菌毒素的吸附能力，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)伏馬毒素的吸附能力最強(qiáng)，對(duì)DON的吸附最弱。隨后，人們開始從食物中篩選分離不同的菌種進(jìn)行研究，如利用Kefiri(主要為乳酸菌和醋酸桿菌)對(duì)AFB1、ZEA和OTA進(jìn)行吸附，吸附量為82%～100%，并證明了在胃腸道中比較穩(wěn)定，不發(fā)生解吸[14]；從酸奶中分離的一種副干酪乳酸菌LHZ-1可以吸附脫除DON，且活細(xì)胞比滅活細(xì)胞效果更好，脫除率達(dá)到40.7%[15]。釀酒酵母可以在5 min內(nèi)去除葡萄汁中90%的OTA[16]。相同條件下，幾種乳桿菌與酵母對(duì)ZEA的吸附效果進(jìn)行了比較，吸附效率最佳菌種為巴氏乳桿菌(53.3%)和釀酒酵母(36.5%)[17]。此外，研究者們不僅關(guān)注微生物與毒素的吸附率，還借助先進(jìn)的設(shè)備觀察與毒素的結(jié)合位點(diǎn)。副干酪乳桿菌可以與AFB1特異結(jié)合，在掃描電鏡下觀察到其細(xì)胞壁表面空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[18]，在胃腸道環(huán)境下觀察酵母與OTA的結(jié)合比在培養(yǎng)基中更加穩(wěn)定[19]。利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌與伏馬毒素的官能團(tuán)結(jié)合，與FB1的結(jié)合最有效[20]，吸附部位為細(xì)胞壁上的多糖和蛋白。酵母葡甘露聚糖和β-葡聚糖也可以有效地減輕黃曲霉毒素的毒性，基本消除飼料中毒素對(duì)肉雞免疫功能和肝腎功能的不良影響[21]。此外，雙歧桿菌屬的微生物和芽孢桿菌等也可以通過生物吸附脫除AFB1、AFM1、OTA等霉菌毒素[22-24](表1)。

表1 各種微生物對(duì)霉菌毒素的吸附作用

注：* 樣品為被霉菌毒素污染的小麥，不同批次間含量相差較大，吸附率為平均值。其余樣品與毒素的吸附過程均在PBS溶液或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行

1.2 生物降解脫毒

降解是生物法脫除霉菌毒素最重要的一個(gè)方面，利用微生物或酶對(duì)毒素特異性降解，得到無毒或低毒的降解產(chǎn)物。微生物分泌的酶多種多樣，對(duì)各種毒素降解方式也不相同，涉及到乙?；⑻腔?、開環(huán)、脫羧等反應(yīng)[1]。

酵母不僅可以吸附AFB1，也可對(duì)其進(jìn)行降解，尤其與枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合發(fā)酵可減少85%以上的AFB1(68.55 ng/mL)[25]。魚腸道中分離的一株枯草芽孢桿菌，可以降解81.5%的AFB1(100 ng/mL)，還能降解AFM1和AFG1[26],但降解產(chǎn)物復(fù)雜。最近研究發(fā)現(xiàn)，紅球菌[27]和擬香味菌[28]都可以有效地對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行降解(表2)。

由于產(chǎn)物多樣，關(guān)于黃曲霉毒素的降解機(jī)理研究大多為推測(cè)。其中，假蜜環(huán)菌被發(fā)現(xiàn)可以分泌氧化酶降解AFB1結(jié)構(gòu)中的雙呋喃環(huán)，通過薄層層析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了經(jīng)過酶處理后的AFB1被完全降解且毒性降低(圖1)[29]。

表2 各種微生物降解霉菌毒素的效果

圖1 假密環(huán)菌降解AFB1中雙呋喃環(huán)脫毒

ALBERTS等[30]研究了54株真菌對(duì)黃曲霉毒素B1的降解作用，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中漆酶活性與AFB1降解率呈現(xiàn)顯著相關(guān)，最佳條件下隔孢伏革菌SCC0152可以降解52.36%的AFB1(1.4 μg/mL)，利用鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行致突變毒性研究，證明降解產(chǎn)物的毒性明顯小于AFB1。黑曲霉、根霉以及不產(chǎn)生AFs的黃曲霉對(duì)于AFB1的降解結(jié)果表明，它們通過還原AFB1的酮羰基或雙呋喃環(huán)上的雙鍵進(jìn)行解毒[31](圖2)。

圖2 部分真菌降解AFB1的產(chǎn)物

此外，多種微生物可以降解ZEA。從瘤胃中分離的1株假單胞菌THN1可以將ZEA(2 μg/mL)作為唯一碳源完全降解利用[32]；芽孢桿菌在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵3 d后可以完全降解濃度為7.45 μg/mL的ZEA[33]，且后續(xù)報(bào)道的地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對(duì)ZEA的降解率均高于85%[34-35](表2)；而乳酸菌降解ZEA(1 μg/mL)最高效率僅為47.8%且過程較為緩慢，達(dá)到45%的降解率需要48 h以上[36]。一些研究推測(cè)了降解ZEA的途徑，如酵母和假絲酵母可以將之還原為玉米赤霉烯醇(zearalenol, ZEL)[37]；絲孢酵母對(duì)ZEA進(jìn)行脫羧處理，使之不再具有雌激素類似結(jié)構(gòu)從而消除毒性(圖3)[38]。納豆芽孢桿菌降解ZEA的途徑如圖3所示，先將ZEA中羰基位置氧化成內(nèi)酯環(huán)，然后通過水解改變其雌激素類似結(jié)構(gòu)，達(dá)到脫毒效果[39]。ZEA也可以通過糖基化、磺酸化等方式降低毒性，但是根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，這些結(jié)構(gòu)在腸道中會(huì)重新水解還原成ZEA，因此不能夠認(rèn)為是有效的脫毒手段[40]。

圖3 部分微生物對(duì) ZEA的降解途徑

伏馬毒素是一類具有長(zhǎng)鏈氨基酸骨架的二酯，它的降解是經(jīng)過羧酸酯酶和氨基轉(zhuǎn)移酶等多步水解完成的[13]。黑色酵母、棘狀霉菌等都可以通過水解酯鍵降解伏馬毒素B1(FB1)[41]。最近發(fā)現(xiàn)，從蘑菇堆肥中分離出的混合菌種，其中假單胞菌占主要成分，可以對(duì)培養(yǎng)基中伏馬毒素B1(10 μg/mL)進(jìn)行完全降解，采用液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了降解產(chǎn)物是一種低毒的物質(zhì)[42](見圖4)，通過羧酸酯酶脫去2個(gè)分子的己三酸生成部分水解伏馬毒素B1(hydrolyzed fumonisin B1, HFB1)，再通過轉(zhuǎn)氨酶作用脫去氨基，形成低毒性的降解產(chǎn)物2-酮-HFB1。

圖4 假單胞菌降解伏馬毒素B1的途徑

根霉和毛霉等真菌能夠?qū)⒁后w培養(yǎng)基中的OTA降解到一個(gè)極低的水平，紅球菌和短桿菌等也能夠降解90%以上的OTA，但需要5～10 d[43-44]。從動(dòng)物腸道分離出一些厭氧微生物可以快速降解OTA，在39 ℃條件下24 h內(nèi)即可降解75%以上的OTA(0.1～1 μg/mL)，尤其是真細(xì)菌屬微生物可以在6 h內(nèi)降解95%的OTA(0.2 μg/mL)[45]。有學(xué)者證明水解OTA中的內(nèi)酯環(huán)可達(dá)到降低毒性的效果[24](圖5)。

圖5 微生物對(duì)OTA的兩種主要降解途徑

從貯藏玉米中分離出1株芽孢桿菌可以通過另一種方式降解OTA，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其分泌的羧肽酶對(duì)OTA中的肽鍵進(jìn)行了水解，生成低毒的代謝產(chǎn)物OT-α(圖5)[46]。此外，小片球菌、黑曲霉、不動(dòng)桿菌等分泌的羧肽酶A、蛋白酶A、脂肪酶和OTA酶等胞外酶和酵母分泌的胞內(nèi)酶都通過此途徑降解OTA，且被認(rèn)為是最有效的降解途徑[47](表2)。

單端孢霉烯類毒素的主要毒性結(jié)構(gòu)在于環(huán)氧結(jié)構(gòu)和特殊位置的羥基或乙?；?，因此，去環(huán)氧化、去乙酰化或者糖基化是微生物脫毒方式[48]。GAO等從雞腸道中分離出1株細(xì)菌，以脫氧雪腐烯醇為底物時(shí)可以氧化脫除其分子上的環(huán)氧結(jié)構(gòu)，對(duì)于T-2毒素、HT-2 和T-2三醇等都具有相似的作用方式[49]。土壤中分離得到的包含梭菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸球菌屬、鏈霉菌屬和單胞菌屬的混合菌種在12～40 ℃、pH 6.0～7.5的條件下可以使DON完全去環(huán)氧化[50]。HE等也做了相似的研究，從土壤中分離出的假單胞菌在48 h內(nèi)完全降解DON(100 μg/mL)生成3-去環(huán)氧-DON，同樣也可以將DON或雪腐烯醇(nivalenol, NIV)變?yōu)?-酮-DON或3-酮-NIV[51](圖6)；乳酸菌分泌胞外酶通過去環(huán)氧化對(duì)DON和T-2毒素進(jìn)行降解，降解率分別為100%和58%[9, 52](表2)。

圖6 單端孢霉烯類毒素的主要降解途徑

由于細(xì)菌可分泌多種酶，一些細(xì)菌可以同時(shí)降解多種毒素。如PETCHKONGKAEW等[53]從發(fā)酵黃豆中分離出1株芽孢桿菌可以降解AFB1和OTA。短桿菌屬中有多種細(xì)菌可以降解多酚芳環(huán)結(jié)構(gòu),并分泌羧肽酶可以用于降解AFs和OTs[43]；紅球菌可以同時(shí)降解AFB1、ZEA和OTA等，與其分泌的內(nèi)酯水解酶有關(guān)[27]。

2 研究展望

生物吸附通過微生物細(xì)胞壁上的多糖和蛋白成分對(duì)霉菌毒素進(jìn)行結(jié)合，被吸附后的毒素即使經(jīng)過胃腸道的消化也不易被釋放，但目前針對(duì)霉菌毒素釋放的實(shí)驗(yàn)多數(shù)為體外模擬，缺乏相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。

生物降解是未來的研究熱點(diǎn)，許多菌種被證明能降解霉菌毒素，但機(jī)理與途徑并不清楚，需要進(jìn)一步探究降解方式、降解產(chǎn)物毒性以及系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法。另外，生物降解霉菌毒素周期大多在12～60 h，有些發(fā)酵降解甚至長(zhǎng)達(dá)30 d，而降解酶分離純化較為困難，大多數(shù)穩(wěn)定性較差，難以滿足生產(chǎn)過程中快速高效的需求，還需進(jìn)一步研究其他快速高效降解的方法。

目前的研究主要集中在單株菌降解單一種類霉菌毒素，而農(nóng)作物污染的霉菌毒素往往不止1種且它們之間具有協(xié)同增強(qiáng)毒性的作用，因此對(duì)單一毒素的脫除研究并不能很好地滿足實(shí)際需求，需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)多種霉菌毒素同時(shí)進(jìn)行降解的研究。理論上，生物降解毒素需要一整套完整的酶系才能徹底解毒，通過多菌種的合理復(fù)配，優(yōu)化發(fā)酵條件，使分泌的各類酶協(xié)同增效、徹底降解同種或多種霉菌毒素也是未來生物降解的發(fā)展趨勢(shì)。