王 廿，賈蒙驁，黃 剛，卯婷婷，趙玳琳，陶 剛*

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550003；2. 貴州省煙草科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005；3. 黔東南州民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000)

【研究意義】草莓(Fragaria×ananassa)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)宿根性多年生草本植物，花白色，屬于漿果類水果；主要分布于亞洲、南美洲、歐洲等地[1-2]。近年來(lái)隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，草莓的栽培面積和產(chǎn)量在世界漿果類水果中躍居第2位，僅次于葡萄，貴州草莓的栽培面積也在逐漸擴(kuò)大[3-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生產(chǎn)上栽種農(nóng)戶購(gòu)買的草莓種苗后多自行繁殖2～3代，由于草莓種苗通過匍匐莖營(yíng)養(yǎng)繁殖而來(lái)，一旦母株帶毒，繁殖的后代均帶毒。單一病毒對(duì)草莓生長(zhǎng)和產(chǎn)量無(wú)明顯影響，2種以上病毒復(fù)合侵染常導(dǎo)致草莓產(chǎn)量逐年遞減，成為草莓生產(chǎn)的巨大隱患[5]。在我國(guó)露地常規(guī)繁殖的草莓種苗，其病毒感染率為每年20 %～30 %，導(dǎo)致產(chǎn)量降低20 %～50 %[6]。植物病毒病害一旦發(fā)生難以控制，造成植株的長(zhǎng)勢(shì)減弱，從而增加了其他病害的侵染幾率，若從根本上解決病毒病的危害，需將病毒的檢測(cè)和預(yù)防提前到草莓組培苗和種苗圃草莓病毒病的檢測(cè)與及時(shí)清除，從而可保證在生產(chǎn)田使用無(wú)毒種苗栽培。我國(guó)草莓種植中有4種常見的病毒病害，分別是草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)、草莓斑駁病毒(Strawberrymottleirus，SMoV)、草毒皺縮病毒(Strawberrycrinklevirus，SCV)和草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)[5-6]。目前頒發(fā)的中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T303《草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》將脫毒種苗分為脫毒原原種苗、脫毒原種苗和脫毒種苗三級(jí)，規(guī)范中明確種苗病毒的檢測(cè)方法為RT-PCR，包括SVBV、SMoV和SMYEV等3種病毒的檢測(cè)，均為陰性才為合格的種苗。草莓病毒最早的檢測(cè)依賴于比較復(fù)雜的電鏡技術(shù)和接種指示植物方法，這些方法特異性周期長(zhǎng)，不易掌握[6-7]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，草莓病毒的檢測(cè)也從單個(gè)病毒的檢測(cè)，逐漸發(fā)展為多重RT-PCR方法[8]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法[9]，提高了檢測(cè)效率和檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性。利用Illumina測(cè)序技術(shù)能同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種病毒，如李偉佳等[10]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在疑似病毒癥狀的草莓葉片分析發(fā)現(xiàn)，草莓壞死休克病(Strawberrynecroticshockvirus，SNSV)、SVBV、SCV和SMYEV等4種草莓病毒，用RT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。Akhter等[11]研究分析侵染草莓的病毒與侵染黃瓜株系的差異，Bhagwat等[12]研究發(fā)現(xiàn)加拿大東部SMYEV分離物的特異性，說(shuō)明一些新病毒或是草莓病毒種間變異在田間的廣泛發(fā)生。為了對(duì)草莓病毒病發(fā)生的危害草莓生產(chǎn)，持續(xù)的監(jiān)測(cè)和明確不同區(qū)域的病害發(fā)生的差異，是進(jìn)行針對(duì)性防控的基礎(chǔ)[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鐘霈霖等[13]通過雜交選育出適宜在貴州地區(qū)栽培具有早熟、高產(chǎn)、抗病和抗逆等特點(diǎn)的新品種：黔莓1號(hào)、黔莓2號(hào)和黔莓3號(hào)；同時(shí)，研究人員在貴州地區(qū)也開展了莖尖組培草莓種苗的研究[14]。但貴地區(qū)的草莓病毒發(fā)生情況以及病毒的遺傳關(guān)系尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，對(duì)貴州地區(qū)草莓病毒病害的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，對(duì)生產(chǎn)田草莓植株和組培植株進(jìn)行常見4種病毒的檢測(cè)，擴(kuò)增SVBV基因組全長(zhǎng)并分別根據(jù)SVBV全基因組序列和完整CP基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、病毒的遺傳變異分析，為無(wú)毒種苗的安全生產(chǎn)和田間防控提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于2017年分別采集貴州省貴陽(yáng)市園藝所溫室大棚、黔東南州凱里市下司鎮(zhèn)溫室大棚和黔東南州民族職院組培中心的草莓植株22、23和32份，品種分別為黔莓1號(hào)、紅顏和章姬。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株和克隆載體pMD-19T等購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，內(nèi)標(biāo)基因、SVBV、SCV、SMoV和SMYEV等片段構(gòu)建的基因陽(yáng)性質(zhì)粒由北京市植物保護(hù)站席昕助理研究員提供。

1.1.3 分子生物學(xué)常用酶及試劑盒 EASY spin植物RNA快速提取試劑盒和植物基因組DNA快速提取試劑盒等購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和PCR Master mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，RNA Inhibitor和LATaqDNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，dNTP和引物合成購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA Marker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[15-16]研究草莓病毒檢測(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；已檢測(cè)到SVBVCP基因片段的樣品cDNA為模板，進(jìn)行SVBV全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增和SVBVCP基因的擴(kuò)增引物參考引物見表1[16-17]，其中部分引物根據(jù)NCBI上登錄的SVBV-SY(GenBank登錄號(hào)：KP311681)、SVBV-BJ(GenBank登錄號(hào)：KR080547)和SVBV-AH(GenBank登錄號(hào)：KX787430)等分離物序列比對(duì)后，根據(jù)保守的核苷酸序列重新設(shè)計(jì)。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增 采用試劑盒提取草莓葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μl：在1.5 mL管中加入2 μl總RNA(約1 μg)、隨機(jī)引物N(6)和Oligo d(T)18引物各0.5 μl、0.5 μl RNase Inhibitor和15 μl去RNA酶ddH2O，70 ℃加熱5 min，立即至于冰上，3 min后加入5 μl 10×M-MLV buffer和1 μl M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃反應(yīng)60 min；72 ℃反應(yīng)10 min。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s或3 min(擴(kuò)增SVBV全長(zhǎng))，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min，20 ℃保存5 min。反應(yīng)結(jié)束后取3 μl PCR產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。

表1 草莓SVBV CP基因及全長(zhǎng)基因組擴(kuò)增的引物Table 1 Primers for amplication of CP and genomic sequence of SVBV

注：*為參考序列：SVBV-BJ，GenBank: KR080547.1。#為新設(shè)計(jì)的引物。

Note: * Reference sequence: SVBV-BJ, GenBank: KR080547.1. # newly designed primers.

1.2.3 SVBV 3個(gè)片段PCR擴(kuò)增及克隆 采用試劑盒提取草莓葉片DNA，將SVBV全長(zhǎng)分為3個(gè)片段擴(kuò)增，其中1對(duì)引物參考FENG等[17]研究，根據(jù)全基因組比對(duì)后進(jìn)行設(shè)計(jì)另外2對(duì)引物(表1)。PCR產(chǎn)物電泳后切出單一目標(biāo)條帶，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書?；厥蘸筮B接到pMD-19T vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐(50 mg/L)的固體LB培養(yǎng)基上，經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落至于含氨芐(50 mg/L)的液體LB培養(yǎng)基于轉(zhuǎn)速為180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過夜。取1 μl菌液通過PCR鑒定，挑選出陽(yáng)性克隆，送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 SVBV CP基因的擴(kuò)增及克隆 采用試劑盒提取草莓葉片DNA，通過引物SVBV CP F和SVBV CP R引物對(duì)擴(kuò)增SVBV的CP基因全長(zhǎng)，將獲得的PCR產(chǎn)物參考1.2.3的方法構(gòu)建到載體上，送陽(yáng)性克隆到上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 擴(kuò)增序列分析 擴(kuò)增的SVBV3個(gè)片段陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果，經(jīng)DNAman軟件進(jìn)行拼接；GenBank中下載已經(jīng)可獲得的5條SVBV基因組序列和試驗(yàn)獲得的貴州分離物全長(zhǎng)，采用軟件Clustalx進(jìn)行序列比對(duì)，在GenBank下載22條SVBV CP核苷酸序列和測(cè)序獲得的CP核苷酸序列采用軟件Clustalx進(jìn)行比對(duì)；將比對(duì)文件導(dǎo)入MEGA7.0采用鄰接法進(jìn)行1000次bootstrap重復(fù)計(jì)算遺傳距離[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見4種草莓病毒的RT-PCR檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)，77份樣品均可擴(kuò)增獲得內(nèi)標(biāo)基因的片段，說(shuō)明檢測(cè)樣品的RNA提取、cDNA合成均良好。以cDNA為模板以SVBV引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR，在7株樣品中擴(kuò)增到約270 bp的片段，經(jīng)測(cè)序及BLAST分析發(fā)現(xiàn)該片段與SVBV-BJ(GenBank登錄號(hào)：KR080547)同源性最高；以SMYEV引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR，在2株樣品中擴(kuò)增到約850 bp的片段，經(jīng)測(cè)序及BLAST分析發(fā)現(xiàn)該片段與SMYEV(GenBank登錄號(hào)：NC003794 )同源性最高。未在任何樣品中擴(kuò)增到SMoV和SCV的預(yù)期大小片段，其中所有檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均與預(yù)期相符。通過RT-PCR檢測(cè)到SVBV和SMYEV病毒，未檢測(cè)到SMoV和SCV病毒；其中SVBV檢出率為19.5 %，SMYEV檢出率為2.6 %(表2)。

表2 檢測(cè)樣品4種草莓病毒病的帶毒率Table 2 The incidence of four strawberry viruses in samples

2.2 SVBV貴州分離物基因組測(cè)序及一致性

對(duì)SVBV進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得與引物設(shè)計(jì)預(yù)期大小相符的條帶，分別為2.8、2.9和3.3 kb(圖1)。通過序列拼接后獲得SVBV-GZ(GenBank登錄號(hào)：MH894295)貴州分離物基因組序列，全長(zhǎng)7859 bp。將SVBV-GZ各編碼蛋白序列和核苷酸序列分別于報(bào)道的其他6個(gè)SVBV分離物進(jìn)行比對(duì)(表2)?；蚪M核苷酸相似性在84.57 %～98.59 %，與SVBV-BJ分離物(GenBank登錄號(hào)：KR080547)相似性較高，達(dá)98.78 %，與pSVBV-E3分離物(GenBank登錄號(hào)：X97304)差異最大，僅84.57 %。其中SVBV-GZ的移動(dòng)蛋白和病毒粒子相關(guān)蛋白的氨基酸序列與SVBV-BJ的和SVBV-AH的氨基酸相似性最高為100 %，與美國(guó)分離物蚜蟲相關(guān)蛋白氨基酸序列最低，為70.19 %。目前，已獲得SVBV7個(gè)分離物的全基因組序列：SVBV-GZ、SVBV-China(GenBank登錄號(hào)：KR080547)、SVBV-SY、SVBV-BJ、SVBV-AH、SVBV-NS(GenBank登錄號(hào)：KX950836)和pSVBV-E3等，在預(yù)測(cè)編碼的6個(gè)開發(fā)讀框中，蚜蟲相關(guān)蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列變化較大，分別為75.51 %～99.59 %和70.19 %～99.38 %；反轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列和氨基酸相似性最高，分別為89.13 %～98.21 %和93.75 %～99.29 %。

分析SVBV-GZ序列，推測(cè)其編碼7個(gè)開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)，與之前報(bào)道的SVBV分離物相似，同屬于花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus)。開放閱讀框Ⅰ(核苷酸 70～1059)推測(cè)編碼移動(dòng)蛋白(329 個(gè)氨基酸)，開放閱讀框Ⅱ(核苷酸1062～1550)推測(cè)編碼蚜蟲傳相關(guān)蛋白(162氨基酸)，開放閱讀框Ⅲ(核苷酸1551～1901)推測(cè)編碼病毒粒子相關(guān)蛋白(116氨基酸)；開放閱讀框Ⅳ(核苷酸1904～3319)推測(cè)編碼外殼蛋白(471氨基酸)；開放閱讀框Ⅴ(核苷酸3411～5525)推測(cè)編碼一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶(704氨基酸)；開放閱讀框Ⅵ(核苷酸5537～7099)推測(cè)編碼內(nèi)含體基質(zhì)蛋白(520氨基酸)；開放閱讀框Ⅶ編碼的蛋白為107氨基酸。非編碼區(qū)有513 bp(核苷酸7100～7612)在開放閱讀框Ⅵ和開放閱讀框Ⅶ之間，該區(qū)段核苷酸序列與報(bào)道的加拿大分離物NS8的相似性達(dá)98.45 %，在這段區(qū)域中有真核生物啟動(dòng)子TATA框(核苷酸7217～7223)和類CAT元件(核苷酸7208～7212)，轉(zhuǎn)錄ploy(A)信號(hào)(核苷酸7322～7328)。

M, DL5000 DNA Marker; 1, SVBV1 F/SVBV1R; 2, SVBV2 F/SVBV2new R; 3, SVBV3new F/SVBV3new R圖1 SVBV-GZ全基因組序列3個(gè)片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of three fragments of SVBV-GZ genomic sequence

2.3 SVBV-GZ與其他分離物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

基于SVBV基因組核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，7個(gè)分離物可分為2個(gè)亞組，pSVBV-E3分離物為其中一個(gè)亞組，其他6個(gè)分離物在另一亞組。SVBV-AH和SVBV-SY在同一分支上，SVBV-BJ和SVBV-GZ在另一分支上(圖2)。對(duì)8條加拿大、8條中國(guó)和1條埃及等17條SVBV分離物CP氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明，來(lái)自不同地區(qū)的SVBV分離物主要?dú)w為3個(gè)大類(圖2)，一組(Group Ⅰ)包括了來(lái)自加拿大的所有分離物，另一組(Group Ⅱ)包括了中國(guó)的所有分離物，還有一組只包括來(lái)自埃及(Group Ⅲ)的分離物。由圖3表明，SVBV分離物與來(lái)自加拿大和埃及的分離物處于不同類群，結(jié)果與全長(zhǎng)基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹符合；SVBV-GZZJ和SVBV-GZFLD與來(lái)自北京、安徽和沈陽(yáng)的SVBV分離物較近的親緣關(guān)系，SVBV-GZHY和SVBV-GZQ3與上分支親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討 論

早在1995年，我國(guó)病毒學(xué)家依靠血清學(xué)反應(yīng)，明確了國(guó)內(nèi)草莓種苗和田間植株中帶毒率較高的4種病毒。由于SVBV是DNA病毒可直接通過PCR進(jìn)行檢測(cè)[19]，檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果無(wú)差別，為方便試驗(yàn)操作全部用cDNA為模板進(jìn)行檢測(cè)。采集時(shí)檢測(cè)的樣品未呈現(xiàn)的葉片褪綠、皺縮或植株矮小等癥狀，對(duì)這些植株進(jìn)行草莓常見4種病毒的檢測(cè)結(jié)果顯示沒有符合侵染的植株，與之前報(bào)道草莓病毒單獨(dú)侵染不會(huì)造成明顯的癥狀較相符[20]。草莓大棚種植一般采用上一年的匍匐莖上萌發(fā)的新苗為種苗，如果母株帶毒則子代將全部為帶毒苗，建議在草莓苗圃和組培苗繁殖過程加強(qiáng)病毒的檢測(cè)[21-22]。由于SVBV和SMYEV的田間傳播介體主要為蚜蟲[21]，因此在草莓苗圃應(yīng)加強(qiáng)蚜蟲的防控。

試驗(yàn)研究首次克隆了SVBV貴州分離物全基因組序列，分析其基因組結(jié)構(gòu)特征。目前在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中已有我國(guó)SVBV的中國(guó)分離物、北京分離物、沈陽(yáng)分離物和安徽分離物的全基因組序列，將獲得的貴州分離物SVBV-GZ全基因組序列、其他中國(guó)地區(qū)分離物、加拿大分離物和美國(guó)分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。中國(guó)地區(qū)分離物與加拿大分離物聚在同一組。進(jìn)一步分析基于SVBV CP氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，SVBV-GZZJ(樣品品種為章姬)和SVBV-GZFLD(樣品品種為法蘭蒂)與北京、安徽和沈陽(yáng)的SVBV分離物親緣關(guān)系較近，其樣品采集地在凱里市下司鎮(zhèn)大棚，主要從外省購(gòu)買種苗種植；SVBV-GZHY(樣品品種為紅顏)和SVBV-GZQ3(樣品品種為黔莓3號(hào))與安徽和沈陽(yáng)的SVBV分離物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)且為另一個(gè)分支，北京SVBV分離物較近，其樣品采集地為貴陽(yáng)市郊區(qū)，種苗來(lái)自貴州省園藝所，可能由于該所地理上隔離栽培、選育和繁殖草莓超過10年，SVBV經(jīng)過進(jìn)化與其他分離物出現(xiàn)更多差異。

圖2 基于SVBV-GZ全長(zhǎng)基因組序列的SVBV分離物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationships of SVBV-GZ with other reported isolates based on genomic

圖3 基于SVBV外殼蛋白氨基酸序列的SVBV分離物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationships of SVBV isolates based on its coat protein amino acid sequences

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)貴州省草莓植株有SVBV和SMYEV 2種病毒，未發(fā)現(xiàn)SMoV和SCV，測(cè)定的SVBV-GZ全基因組序列與已報(bào)道的SVBV-BJ分離物的序列相似性最高。