林 玲,劉芷君,曾文治,雷鄭延,林全女,程福建,楊江帆,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002;2.茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350002)

高脂血癥通常指血清中TC和(或)TG水平升高[1],是“三高”之一,時(shí)刻威脅著人類(lèi)的生命和財(cái)產(chǎn)安全,我國(guó)血脂異常人數(shù)高達(dá)18.6%[2]。高脂血癥使不利于機(jī)體健康的相關(guān)物質(zhì)大量積累,導(dǎo)致肝臟負(fù)擔(dān)過(guò)重、血管血栓沉淀等[3],同時(shí),高脂血癥還會(huì)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等多種并發(fā)癥[2,4-5]。2010～2030年,我國(guó)心血管患者人數(shù)將因血清膽固醇水平的升高約增加920萬(wàn)[6]。高膽固醇血癥患者也日趨低齡化[7]。目前市場(chǎng)上治療高脂血癥的藥物繁多,如西藥中的貝特類(lèi)、煙酸類(lèi)及他汀類(lèi)的藥物,但長(zhǎng)期使用將產(chǎn)生副作用、耐藥性及依賴(lài)性等反應(yīng)[1]。因此研究與開(kāi)發(fā)副作用低的保健產(chǎn)品勢(shì)在必行。

20世紀(jì)60年代,茶葉的保健功效逐漸引起人們的關(guān)注,人們對(duì)茶葉中的生物活性成分進(jìn)行了深入研究,主要包括茶多酚、黃酮類(lèi)及茶氨酸等物質(zhì),但茶皂苷仍未引起關(guān)注。直到2005年,Yoshikawa等[8]發(fā)現(xiàn)茶花皂苷Floratheasaponin A-C有較好的抑制TG的作用。隨后幾年,國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展對(duì)茶皂苷降血脂功效的研究。Ye等[9]用油茶皂苷及其水解產(chǎn)物喂食高脂血癥小鼠,發(fā)現(xiàn)可降低TC、TG和低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL),并增加高密度脂蛋白(high density lipoproteins,HDL)的含量。王延芳[10]的研究也驗(yàn)證了這一結(jié)論。吳文鶴等[11]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)根皂苷可調(diào)控血脂水平。Afrose等[12]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)根皂苷能顯著降低血清中LDL、TG和TC的含量。目前,針對(duì)茶皂苷調(diào)節(jié)血脂的研究多選用油茶籽、茶樹(shù)花、茶樹(shù)根等部位的皂苷,尚未發(fā)現(xiàn)以茶籽皂苷為對(duì)象的研究,同時(shí)對(duì)肝脂肪變性、肝功能、抗氧化水平影響以及調(diào)節(jié)血脂機(jī)制的研究匱乏。

茶皂苷是一類(lèi)齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)皂苷的混合物,由皂苷元、糖體、有機(jī)酸三部分組成。科研工作者從同一物種中分離出不同的皂苷,到目前已從山茶屬植物的根、莖、葉、花和種子中分離和鑒定了188種皂苷單體,其中,87種來(lái)自茶(CamelliasinensisL.),33種來(lái)自日本山茶(CamelliajaponicaL.),24種來(lái)自阿薩姆茶(CamelliasinensisL. var.assamicaPierre),37種來(lái)自油茶(CamelliaoleiferAbel.),7種來(lái)自茶梅(CamelliasasanquaThunb.);大部分皂苷(72種)分離于山茶屬植物的種子,其中在茶籽中發(fā)現(xiàn)39種;在茶樹(shù)花中發(fā)現(xiàn)16種、根莖中10種、茶葉中9種,其他13種。它們結(jié)構(gòu)相似又有所不同,比如茶籽皂苷和茶葉皂苷:皂苷元結(jié)構(gòu)眾多,其中R1-黃槿精醇和A1-黃槿精醇是茶葉皂苷具備而茶籽皂苷不具備的;關(guān)于有機(jī)酸,茶葉皂苷為當(dāng)歸酸、惕各酸和肉桂酸,而茶籽皂苷中不具有肉桂酸;二者糖體相同[13-14]。對(duì)茶樹(shù)的利用多集中在其葉片上,除了一小部分茶籽用于育種外,其余多被廢棄。據(jù)農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司統(tǒng)計(jì),2016年全國(guó)茶園面積2902100 hm2,按每畝茶園產(chǎn)茶籽50 kg,我國(guó)每年潛在茶籽資源約217. 7萬(wàn)t,茶皂苷作為茶籽主要有效成分,具有重大開(kāi)發(fā)潛力。

因此本文選用茶籽皂苷進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),通過(guò)病理切片以及對(duì)大鼠血脂和抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)研究其調(diào)節(jié)血脂的功效,為茶皂苷降血脂產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論支持,以期為茶深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽皂苷 湖南漢清生物技術(shù)有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC) 上海源葉生物科技有限公司;辛伐他汀片 湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司;SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只,體重(200±20) g 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002;對(duì)硝基苯酚、水合氯醛(分析純) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;SOD、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所;高脂飼料(輻照) 北京博愛(ài)科貿(mào)有限公司(配方:蛋黃粉10%、豬油5%、膽固醇5%、膽鹽0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、基礎(chǔ)飼料79.3%);普通飼料 福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

KDC-2046低速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;日立7180全自動(dòng)生化分析儀 株式會(huì)社日立制作所;TE601-L電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) SHIMADZU Corporation。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 本實(shí)驗(yàn)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:室溫22～26 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,明暗交替條件為12 h/12 h。大鼠均在同一環(huán)境下隨機(jī)分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲水?dāng)z食。

60只雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為10只正常組和50只造模組。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料,造模組飼喂高脂飼料。4周后禁食12 h斷尾取血,檢測(cè)TC 與正常組有顯著差異(P<0.05),則造模成功,將造模組按體重隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和茶籽皂苷低、中、高劑量組。各組按照表1給藥方式每日上午定時(shí)連續(xù)給藥四周,末次給藥后24 h(禁食不禁水12 h),10%水合氯醛麻醉(2 mL/kg,腹腔注射)大鼠取樣保存待測(cè)。所用灌胃藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑進(jìn)行配制。

表1 動(dòng)物分組與給藥方法Table 1 Animal grouping and administration method

1.2.2 大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第一天、最后一天所有大鼠稱(chēng)重,期間每周定時(shí)稱(chēng)量大鼠體重,每日記錄和觀察大鼠精神狀態(tài)、飲水、飲食量等情況。大鼠取樣后計(jì)算大鼠肝臟指數(shù),肝臟指數(shù)(%)=肝臟濕重(g)/體重(g)×100。

1.2.3 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定 自大鼠腹主動(dòng)脈取血,于3 000 r/min離心10 min后取血清,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT含量,計(jì)算AI指數(shù):AI=([TC]-[HDC-C])/[HDL-C]。

1.2.3.2 MDA、SOD含量測(cè)定 分別采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法和羥胺法,按各試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA和SOD含量。

1.2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠部分肝臟用0. 9%氯化鈉溶液沖洗,浸泡于通用型組織固定液過(guò)夜,經(jīng)石蠟包埋及切片后得到約4 μm 的切片,用HE染色后至光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示。使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,差異顯著性用P<0.05(顯著)或P<0.01(極顯著)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立

造模4周后,造模組血清TC(2.10±0.09 mmol/L)明顯高于正常組(1.36±0.03 mmol/L),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明高脂血癥模型已成功建立[1,16-18]。

2.2 大鼠狀態(tài)行為分析

藥物干預(yù)過(guò)程中,C組大鼠精神狀態(tài)好,活潑好動(dòng)且反應(yīng)敏捷,H組大鼠體態(tài)變大,精神相對(duì)萎靡,活動(dòng)量少。而攝入茶皂苷和辛伐他汀的TSL組、TSM 組、TSH組以及P組大鼠體態(tài)較H組小,精神狀態(tài)較好,活動(dòng)有所增多。如表2所示,各組大鼠每周平均每天飲水量和飲食量不存在顯著差異(P>0.05),說(shuō)明茶籽皂苷抑制大鼠體重增長(zhǎng)并非通過(guò)減少其食物攝入實(shí)現(xiàn)的。

表2 各組大鼠飲水量和飲食量Table 2 Water consumption and diet of rats in each group

2.3 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠體重、肝臟指數(shù)的影響

肥胖與高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切,而體重是大鼠肥胖程度最直觀的顯示指標(biāo)之一[19-20]。如圖1所示,干預(yù)前,造模組各組大鼠的體重并無(wú)顯著差異(P>0.05)。干預(yù)4周后,H組大鼠體重相比C組極顯著提升(P<0.01);而P組、TSL組、TSM組、TSH組大鼠體重雖高于C組,但較H組都有所下降,其中P組、TSH組極顯著降低(P<0.01),TSM組顯著降低(P<0.05),TSL組也有所降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明茶籽皂苷能控制高脂血癥大鼠的體重,與P組相一致,且呈量效關(guān)系。

圖1 大鼠體重變化趨勢(shì)Fig.1 Variation of body weight of rats注:與C組比較,##表示極顯著(P<0.01),#表示顯著(P<0.05);與H組比較,**表示極顯著(P<0.01),*表示極顯著(P<0.05),圖2、圖4、表3、表4同。

肝臟指數(shù)變化可以較好地判斷肝臟的損傷情況,增加表示肝臟有充血、水腫、增生及肥大等變化,下降則表示臟器萎縮、生長(zhǎng)受阻或退行性變[21]。如圖2所示,H組大鼠的肝臟指數(shù)比C組極顯著提高(P<0.01),與H 組相比,P組、TSM 組、TSH組的肝臟指數(shù)極顯著下降(P<0.01),TSL組沒(méi)有顯著性差異。H 組大鼠肝臟指數(shù)極顯著地升高可能與一系列的病理變化有關(guān),經(jīng)過(guò)茶籽皂苷和辛伐他汀的干預(yù)可能對(duì)肝臟的病理性變化有所改善。

圖2 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of tea seed saponin on liver index in rats with hyperlipemia

2.4 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

臨床上血脂檢測(cè)的基本項(xiàng)目為T(mén)C、TG、LDL-C和HDL-C。AI為醫(yī)學(xué)中用以觀察動(dòng)脈硬化程度的指標(biāo),AI值的升高,能促進(jìn)HDL-C將血液中的膽固醇運(yùn)到肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)化和排泄,以降低血液中膽固醇濃度,促進(jìn)大鼠外周組織細(xì)胞中的膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn),從而減少其在外周組織中的聚集和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的廣泛性損害[1,22]。由表3可知,給藥4周后,與C組相比,H組大鼠血清中TC含量和AI指數(shù)極顯著升高(P<0.01),HDL-C 含量極顯著降低(P<0.01),TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.05);與H 組相比,TC含量P組、TSL組、TSM組、TSH 組均極顯著降低(P<0.01);TG含量P組、TSH組極顯著降低(P<0.01),TSL組、TSM組顯著降低(P<0.05),以TSH 組效果最佳,甚至優(yōu)于P組;HDL-C 含量P組、TSH組極顯著升高(P<0.01),TSL組、TSM組顯著升高(P<0.05);LDL-C含量P組極顯著降低(P<0.01),茶籽皂苷各組有所降低,但無(wú)顯著性差異;AI指數(shù)P組、TSM組、TSH 組極顯著降低(P<0.01),TSL組顯著降低(P<0.05)。研究結(jié)果表明,茶籽皂苷對(duì)由高脂飼料誘發(fā)的高脂血癥大鼠的血脂水平具有較好的調(diào)節(jié)作用,對(duì)動(dòng)脈硬化也有一定的改善作用,且呈量效關(guān)系,茶籽茶皂苷高劑量組對(duì)大鼠血脂的調(diào)節(jié)效果最佳。

表3 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠血脂含量的影響Table 3 Effect of tea seed saponin on blood lipids in rats with hyperlipemia

2.5 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠肝功能的影響

肝為脂類(lèi)、糖類(lèi)以及蛋白質(zhì)代謝的主要器官。ALT和AST是肝功能的代表性指標(biāo),其數(shù)值的高低直接地體現(xiàn)肝細(xì)胞的損傷程度,越高表明肝臟受損程度越大[23]。如表4所示,H組的ALT與AST含量比C組極顯著提高(P<0.01);與H 組相比,P組、TSH組的ALT與AST含量顯著下降(P<0.05),TSL組、TSM組無(wú)顯著性差異,說(shuō)明高脂血癥會(huì)使大鼠肝功受損,而茶籽皂苷和辛伐他汀擁有一定的保肝功效,且茶籽皂苷以高劑量的效果最佳。

表4 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠ALT、AST含量的影響Table 4 Effect of tea seed saponin on ALT and AST content in rats with hyperlipemia

2.6 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響

不同處理大鼠的肝組織HE染色切片如圖3所示。C組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則整齊,肝竇清晰可見(jiàn),未出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性。H組大鼠肝臟細(xì)胞腫脹、體積增大,眾多大小不一的脂滴出現(xiàn)在胞漿內(nèi),細(xì)胞間隙增大,完整性較差,結(jié)構(gòu)輪廓模糊,部分細(xì)胞甚至解體,說(shuō)明高脂血癥可引起肝臟的病理性變化。與H組比,P組、TSL組、TSM組、TSH 組均可不同程度改善大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性,縮小胞漿內(nèi)脂滴體積,減少其數(shù)量,肝竇更為清晰,且呈量效關(guān)系,以TSH組效果最佳,甚至優(yōu)于P組。脂肪肝發(fā)生率隨著TG濃度的增高而升高[24],肝臟切片的結(jié)果正好與血清TG的結(jié)果相呼應(yīng),因此推測(cè)是因茶籽皂苷能有效降低血清TG含量,致使其改善肝臟脂肪變性效果佳。

圖3 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響(200×)Fig.3 Effect of tea seed saponin on fatty degeneration of liver in rats with hyperlipemia(200×)

2.7 茶籽皂苷對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化水平的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物之一,可間接反映過(guò)氧化損傷程度。SOD可清除超氧陰離子自由基,反映機(jī)體的抗氧化能力[25-26]。如圖4所示,相比C 組,H組大鼠血清中SOD含量極顯著降低(P<0.01)、MDA含量極顯著升高(P<0.01);與H 組相比,P組血清SOD含量極顯著升高(P<0.01),TSL組、TSM組、TSH組顯著提高(P<0.05);P組、TSM 組、TSH 組的血清MDA含量極顯著下降(P<0.01),TSL組無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明茶籽皂苷和辛伐他汀能提高高脂血癥大鼠血清SOD活性,降低MDA活性,能提高抗氧化水平,改善高脂血癥帶來(lái)的氧化損傷,從而改善大鼠血脂水平。

圖4 茶籽皂苷對(duì)高血脂癥大鼠抗氧化水平的影響Fig.4 Effect of tea seed saponins on antioxidant level in rats with hyperlipidemia

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,適當(dāng)劑量的茶籽皂苷(50～150 mg/kg)能有效調(diào)節(jié)高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠的血脂水平,且其效果與劑量濃度成正比。TSH組的體重、肝臟指數(shù)、血清TC、TG、AI指數(shù)極顯著降低(P<0.01),HDL-C極顯著升高(P<0.01),ALT與AST顯著下降(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度明顯改善,SOD顯著提高(P<0.05),MDA極顯著下降(P<0.01);TSM組的體重、血清TG顯著降低(P<0.05),肝臟指數(shù)、血清TC、AI指數(shù)、MDA極顯著下降(P<0.01),HDL-C、SOD顯著升高(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度改善;TSL組的體重、肝臟指數(shù)、MDA沒(méi)有顯著性差異,血清TC極顯著降低(P<0.01),TG、AI指數(shù)顯著降低(P<0.05),HDL-C、SOD顯著升高(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度改善。綜上所述,茶籽皂苷能調(diào)節(jié)喂食高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的血脂水平,減輕肝臟脂肪變性程度,同時(shí)還能改善高脂血癥帶來(lái)的氧化損傷和肝臟損傷,提高機(jī)體的抗氧化能力,有望成為安全有效的抗高脂血癥候選藥,但其機(jī)制有待進(jìn)一步完善檢驗(yàn)。