趙圓圓,楊曉君,王秋平,馮 甜,張 圣,阿布杜薩拉木·艾麥爾

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

我國是世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家,其中Ⅱ型糖尿病占90%以上[1],2010年我國糖尿病標(biāo)準(zhǔn)化患病幾率達(dá)到了11.6%,糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)達(dá)到了1.139億人次,而糖尿病前期患病率則到了讓人吃驚的50.1%的比率,其人數(shù)達(dá)到了 4.934億人次,成為全球患糖尿病增長速度最快的國家之一[2]。近幾十年來,隨著人們生活水平的日益提高,高脂飲食的攝入過多,肥胖患者不斷增加。遺傳、環(huán)境、感染等諸多因素導(dǎo)致胰島素抵抗,糖尿病的發(fā)生率逐年上升,且逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢[3]。糖尿病給社會醫(yī)療保障帶來了沉重的壓力,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。

紅花籽油,其富含亞油酸(ω-6脂肪酸),是已知植物食用油中含量最高的,平均含量78%左右[4]。現(xiàn)代研究表明,紅花籽油具有軟化心腦血管、促進(jìn)血液循環(huán)、降血脂、降血壓等作用[5-6],素有“血管清道夫”的美譽(yù),是當(dāng)之無愧的“亞油酸之王”。馬琳[7]通過給SD大鼠連續(xù)灌胃紅花籽油8周,得出紅花籽油能顯著升高大鼠血清中NO含量(P<0.01),并且能在一定程度上降低ET-1含量,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。亞麻籽油,具有非常高的油活性,含有豐富的亞麻酸(ω-3脂肪酸),平均含量57%左右。亞麻酸是脂肪酸代謝中重要的調(diào)節(jié)因子,能夠抑制脂肪合成,促進(jìn)脂肪分解,具有降低血脂、保護(hù)心腦血管,對高血壓、心臟病、糖尿病以及肥胖等有積極的防治作用[8-13]。

亞油酸(LA)和亞麻酸(ALA)分屬不同系列的必需脂肪酸,在機(jī)體內(nèi)不能互相轉(zhuǎn)化[14-16],但在體內(nèi)經(jīng)同種酶代謝(脫氫酶和增碳酶),具有競爭性,競爭能力為ω-3>ω-6,即同一劑量的LA和ALA,ALA會產(chǎn)生更大的生物效應(yīng)。因?yàn)長A(ω-6)和ALA(ω-3)在體內(nèi)的競爭性,其機(jī)體攝入量和二者比例成為研究熱點(diǎn),嚴(yán)文波等[17]報(bào)導(dǎo)了人體必需脂肪酸攝入平衡的臨床研究,若ω-6/ω-3比率為4∶1,就能使心血管疾病的病死率下降70%。齊珂珂等[18]探討了不同比例LA和ALA對雞原代干細(xì)胞增殖的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LA/ALA比值為10時(shí)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。因此確定LA和ALA最佳比例至關(guān)重要[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)通過研究不同比例和劑量的紅花籽、亞麻籽油對Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影響,進(jìn)行糖耐量試驗(yàn),并使用小鼠INS酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定小鼠胰島素水平。計(jì)算小鼠血糖(AUC)相對值、HOMA-β和HOMA-IR。以期探討不同配比和劑量的紅花籽、亞麻籽油對Ⅱ型糖尿病小鼠糖脂代謝的影響,為緩解Ⅱ型糖尿病的病癥提供理論依據(jù)。為新疆紅花籽油和亞麻籽油的精深加工及糖尿病人群功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級KM種小鼠120只,雌雄各半,體質(zhì)量18～22 g 購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK[新]2016-0003),正常飼養(yǎng)一周并觀察無異常反應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn);飼料為滅菌全價(jià)柱狀飼料 由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;高脂高糖乳 實(shí)驗(yàn)室自制(10%膽固醇、20%豬油、2%膽酸鈉和30%蔗糖);檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖 分析純,天津永晟精細(xì)化工有限公司;羧甲基纖維素鈉 分析純,天津市精細(xì)化工研究所;膽固醇 成都市科龍化工試劑廠;膽酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蔗糖 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;吐溫-80 天津市福晨化學(xué)試劑廠;丙二醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠;鏈脲佐菌素 生物技術(shù)級,上海麥克林生化科技有限公司;紅花籽油 明亮的淺黃色油脂,亞油酸含量為78～83%,新疆紅花緣科技有限公司;亞麻籽油 明亮的黃色油脂,新疆紅果實(shí)生物制品有限公司;去離子水、亞麻籽油提取物 實(shí)驗(yàn)室自制,亞麻籽油提取物中α-亞麻酸含量為60.07%[22];小鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒E-EL-M2614c Elabscience公司。

PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;FA2004N電子分析天平(d=0.1 mg)上海菁海儀器有限公司;三諾GA-3型血糖儀及血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司;Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī) 力康生物科技有限控股公司;Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀 Thermo scientific公司;ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱 日本ASONE公司;C2500-R-230V微型高速離心機(jī) 美國Labnet公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 檸檬酸鈉緩沖液的配制:稱量檸檬酸2.10 g,用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中,配制成A液;稱量2.94 g檸檬酸三鈉,用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中,配制成 B液;按一定比例混合A∶B=1∶1.32混勻成C液,調(diào)整pH至 4.2～4.5間,于4 ℃冰箱保存24 h。

STZ的配制:注射之前將C液配制成1%(w/v)的STZ鏈脲佐菌素緩沖液,配制好的STZ溶液需按劑量在5 min 內(nèi)注射完畢,現(xiàn)用現(xiàn)配,并時(shí)刻置于冰浴中備用。

高脂高糖乳的配制:取豬油20 g置于500 mL燒杯中,在電爐上加熱融化,加入10 g膽固醇,融化,再加入2 g膽酸鈉和30 g蔗糖,充分?jǐn)噭?。然后放?0 mL吐溫-80,20 mL丙二醇及30 mL蒸餾水,不斷攪拌至溶解后,再加蒸餾水至100 mL,并充分混勻,即成高脂高糖乳劑。

1.2.2 小鼠的分組與Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立 將擬建模120只小鼠按體重隨機(jī)分成2組,10只小鼠給予維持基礎(chǔ)生長活動(dòng)飼料量作為正常組,其余作為模型組,每7 d稱量體重1次。模型組給予高脂高糖乳,劑量為10 mL/kg,28 d后,低劑量多次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液4 d,劑量為30 mg/kg,72 h后,正常組和模型組小鼠禁食后采尾靜脈血,測其血糖,若空腹血糖值>11.1 mmol/L即Ⅱ型糖尿病模型造模成功[23]。再將模型組小鼠隨機(jī)分為11組,每組10只,雌雄各半,組別為陽性對照組(二甲雙胍組)、模型組、紅花籽油分別以20%、40%、60%比例和80%、60%、40%亞麻籽油提取物組成的高、中、低三個(gè)劑量的復(fù)合油組,文中按A低、中、高劑量組,B低、中、高劑量組,C低、中、高劑量組表示。A為20%紅花籽油與80%亞麻籽油提取物復(fù)合;B為40%紅花籽油與60%亞麻籽油提取物復(fù)合;C為60%紅花籽油與40%亞麻籽油提取物復(fù)合。灌胃過程中每組均給予等量正常飼料飼養(yǎng),灌胃劑量依照世界衛(wèi)生組織推薦的植物油攝入量進(jìn)行設(shè)置,正常對照組給予相同劑量的生理鹽水,陽性對照組按照體表面積法換算給藥劑量,陽性對照組灌胃二甲雙胍0.3 g/(kg·d),各比例復(fù)合油分別按0.18、0.36、0.54 g/(kg·d)的劑量灌胃小鼠,持續(xù)灌胃30 d。

1.2.3 不同比例受試物對Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響 造模成功后每灌胃7 d,于固定時(shí)間記錄小鼠的空腹體重,并計(jì)算平均體重。

1.2.4 不同比例受試物對Ⅱ型糖尿病小鼠糖耐量的影響 造模成功后每10 d對各組小鼠禁食不禁水12 h后,用采血針尾靜脈采血測定空腹血糖,并給小鼠口服灌胃2 g/kg葡萄糖,分別測定0、30、60、90、120 min后的血糖值[24]。

1.2.5 不同比例受試物對Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素水平的影響 將持續(xù)灌胃給藥30 d的各組小鼠禁食不禁水12 h后,眼眶取血1 mL置于2 mL離心管中,室溫靜置2 h,再于4 ℃冰箱靜置4 h以上,4 ℃,3000 r/min(r=8 cm)離心 5～10 min,轉(zhuǎn)移上層淡黃色血清[25],并用胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定空腹血清胰島素水平(FINS),計(jì)算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(Homa beta cell function index,HOMA-β)和胰島素抵抗指數(shù)(Homa insulin resistanceindex,HOMA-IR)。

1.2.6 指標(biāo)的測定

1.2.6.1 空腹血糖 小鼠禁食不禁水,尾靜脈取血,可利用血糖試紙和血糖儀檢測。以mmol/L表示。

1.2.6.2 血糖曲線下面積 GAUC=(0.25×0 min血糖值+4×30 min血糖值3×120 min血糖值)

式中:GAUC為血糖曲線下面積[26]

1.2.6.3 胰島素指數(shù)測定 胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=In[(胰島素(FINS)×空腹血糖(FBG))/22.5]

胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)=In[20×胰島素(FINS)/(空腹血糖(FBG)-3.5)]

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型建立

2.1.1 造Ⅱ型糖尿病小鼠模型期間小鼠體重分析 由表1可知,在造模前正常組與模型組體重基本一致,在造模期間,高血糖模型組小鼠均高于正常組小鼠體重,這可能是因?yàn)槟Ｐ托∈笪桂B(yǎng)的高脂高糖飼料使得體重增長幅度增大。正常組小鼠體重0～28 d均呈增長趨勢,與正常組相比,高血糖模型組在造模0～21 d體重呈增長趨勢,增長幅度大于同時(shí)間段的正常組小鼠,在21～28 d間體重略有下降,這可能是因?yàn)槟Ｐ徒M出現(xiàn)了糖尿病中的“一少”表現(xiàn)即體重減輕。造模前,正常組與高血糖模型組小鼠體重?zé)o差異(P>0.05),造模28 d時(shí),正常組與模型組小鼠體重差異極顯著(P<0.01),且模型組體重出現(xiàn)下降,空腹血糖均值高于17.0 mmol/L,說明Ⅱ型糖尿病小鼠模型構(gòu)建效果良好。且造模成功后小鼠的體征表現(xiàn)為進(jìn)食進(jìn)水量增大,排尿次數(shù)增多尿量多,墊料潮濕,體重減輕,毛色雜亂暗沉。

表1 造模階段小鼠體重分析(g)Table 1 Analysis of mice body weight during modeling(g)

2.1.2 不同受試物對小鼠體重的影響 由表2可知,與正常對照組相比,模型組數(shù)據(jù)體重減輕明顯,從第14 d開始體重極顯著減輕(P<0.01)。陽性對照組及不同比例的受試物組體重均呈增長趨勢,與模型組相比,B高、中、低劑量組體重均在第14 d開始出現(xiàn)極顯著增長(P<0.01),其余組體重在第21 d開始出現(xiàn)極顯著增長(P<0.01)。說明不同比例的受試物均可以緩解糖尿病中“三多一少”中的體重減輕,受試物組與陽性對照組差異不大,且40%紅花籽油與60%亞麻籽油提取物復(fù)合油組(高、中、低劑量)緩解體重減輕癥狀的效果更明顯。

表2 造模成功后灌胃給藥期間小鼠體重變化(g)Table 2 Changes in body weight of mice during intragastric administration after successful modeling(g)

2.2 不同比例受試物對進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響

由表3可知,第10 d正常對照組與模型組相比,模型組血糖差極顯著升高(P<0.01),說明模型組不能促進(jìn)胰島素的分泌;與模型組相比,陽性對照組,B低、高劑量組C中、高劑量組血糖應(yīng)答曲線下面積顯著減少(P<0.05),說明其能夠促進(jìn)葡萄糖在小鼠體內(nèi)吸收從而促進(jìn)胰島素的分泌使血糖降低;B中劑量組血糖應(yīng)答曲線下面積極顯著減少(P<0.01),說明B中劑量組可以有效緩解小鼠餐后血糖濃度升高,有效促進(jìn)胰島素地分泌從而改善其調(diào)控血糖的能力,因此灌胃給藥第10 d B中劑量組降血糖效果最為明顯。從而也表明了LA和ALA是兩種對人體健康非常重要的必需脂肪酸,攝入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)變?yōu)镋PA(Eicosapntemacnioc acid)和DHA(docosahexaenoic acid)而發(fā)揮降低血脂和血糖的作用[27],且攝入時(shí)間越長效果越明顯。

表3 第10 d不同比例受試物對進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響Table 3 Effect of different proportions of test substances on blood glucose production after glucose consumption on the 10th day

由表4可知,第20 d正常對照組與模型組血糖差異極顯著(P<0.01),與模型組相比,A低、高劑量組,B高劑量組,C低、高劑量組血糖應(yīng)答曲線下面積減少,但不顯著(P>0.05),說明其調(diào)控血糖能力相對較弱;陽性對照組、A中劑量組血糖應(yīng)答曲線下面積顯著減少(P<0.05),說明其能夠促進(jìn)胰島素的分泌使血糖降低;B低、中劑量組,C中劑量組灌胃20 d后降血糖效果優(yōu)于陽性對照組,血糖應(yīng)答曲線下面積明顯極顯著減少(P<0.01),說明其均能夠促進(jìn)葡萄糖在小鼠體內(nèi)吸收從而促進(jìn)胰島素的分泌使血糖降低,改善調(diào)控血糖的能力。因此灌胃給藥第20 d B低、中劑量組,C中劑量組降血糖效果最明顯。

表4 第20 d不同比例受試物對進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響Table 4 Effect of different proportions of test substances on blood glucose production after glucose ingestion on the 20th day

由表5可知,第30 d正常對照組與模型組血糖差異極顯著(P<0.01)。A低、高劑量組,B高劑量組,C低、中、高劑量組降糖效果弱于陽性對照組且血糖應(yīng)答曲線下面積減少不顯著(P>0.05)。陽性對照組血糖應(yīng)答曲線下面積顯著減少(P<0.05),說明灌胃給藥二甲雙胍30 d能促進(jìn)胰島素的分泌使小鼠血糖下降,A中劑量組,B低、中劑量組灌胃 30 d后降血糖效果優(yōu)于陽性對照組,血糖應(yīng)答曲線下面積明顯極顯著減少(P<0.01)其中B中劑量組第10、20、30 d血糖應(yīng)答曲線下面積均極明顯減少,因此得出灌胃給藥30 d B中劑量組緩解小鼠餐后血糖濃度升高及改善調(diào)控血糖的能力最明顯。

表5 第30 d不同比例受試物對進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響Table 5 Effect of different proportions of test substances on blood glucose production after glucose ingestion on the 30th day

2.3 不同比例受試物對Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素敏感性的影響

由表6可看出,模型組血清胰島素含量與正常對照組相比,顯著升高(P<0.05)。陽性對照組與不同比例的受試物組與模型組相比,陽性對照組、B低、中、高劑量組及C高劑量組血清胰島素水平降低顯著(P<0.05)。受試物組中B中劑量組血清胰島素水平降低更明顯,說明灌胃給予0.36 g/kg劑量的40%紅花籽油和60%亞麻籽油提取物復(fù)合降糖效果最好。

表6 不同受試物對小鼠胰島素敏感性的影響Table 6 Effect of different test substances on insulin sensitivity in mice

模型組胰島β細(xì)胞能力與正常對照組相比,差異顯著(P<0.05),模型組胰島β細(xì)胞功能指數(shù)僅為1.29,說明該模型組小鼠胰島β細(xì)胞能力受損。與模型組相比,陽性對照組,A中高劑量組與B中劑量組胰島β細(xì)胞功能指數(shù)極顯著增強(qiáng)(P<0.01),B低劑量組與C低劑量組胰島β細(xì)胞功能指數(shù)顯著增強(qiáng)(P<0.05),說明該比例和劑量下能使胰島β細(xì)胞分泌能力增強(qiáng),緩解糖尿病,同時(shí)也說明了紅花籽油、亞麻籽油緩解糖尿病病癥效果良好。

正常對照組與模型組胰島素抵抗指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比,陽性對照組、A中劑量組與B中劑量組胰島素抵抗指數(shù)下降極顯著(P<0.01),B低、高劑量組胰島素抵抗指數(shù)下降顯著(P<0.05)。陽性對照組、A中劑量組與B中劑量組分別比模型組胰島素抵抗指數(shù)下降57.14%、57.14%與66.67%。A中劑量組與陽性對照組對胰島素抵抗降低效果相同,B中劑量組對胰島素抵抗改善效果最佳。綜合來看B中劑量組能有效改善胰島素抵抗,使胰島β細(xì)胞分泌能力增強(qiáng),更能有效的緩解Ⅱ型糖尿病病癥。

3 討論與結(jié)論

不同配比紅花籽、亞麻籽油均可使Ⅱ型糖尿病小鼠血糖得到降低,B中劑量組降低糖尿病小鼠餐后血糖效果最明顯,改善調(diào)控血糖的能力最佳,并且B中劑量組血清胰島素分泌水平高,改善葡萄糖耐受,胰島β細(xì)胞功能指數(shù)增強(qiáng),胰島素抵抗指數(shù)降低,可得出B中劑量組(即40%紅花籽油、60%亞麻籽油提取物中劑量組)能夠提高其胰島素的分泌及靶細(xì)胞對胰島素的敏感性,降糖效果最佳。

本實(shí)驗(yàn)主要篩選對Ⅱ型糖尿病模型小鼠血糖干預(yù)作用最佳的紅花籽、亞麻籽油的比例及劑量,后續(xù)將從機(jī)制出發(fā),深入探討紅花籽亞麻籽復(fù)合油對Ⅱ型糖尿病大鼠血糖干預(yù)作用的信號通路,基于該信號通道分析對糖尿病產(chǎn)生直接原因的主要靶器官及并發(fā)癥相應(yīng)部位的影響,也為紅花籽亞麻籽復(fù)合油的降血糖機(jī)制研究提供一定的思路及指導(dǎo)。