線粒體靶向抗氧化劑MitoQ在豬卵母細胞冷凍保存中的應用

王文杰，葛 雷，張樹山，吳彩風，戴建軍，張德福*

(1 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海201106)

哺乳動物配子及胚胎冷凍保存在種質資源保存和跨區(qū)域種質資源交流上具有重要意義。近年來，玻璃化冷凍技術已經(jīng)有了很大的進步，但由于豬卵母細胞內脂肪含量較高，對低溫較為敏感，極易受到低溫損傷，冷凍后發(fā)育能力與其他動物相比較低[1-2]。線粒體是哺乳動物卵母細胞中重要的細胞器之一，是細胞內三磷酸腺苷(ATP)的提供者和早期胚胎發(fā)育的唯一能量來源，在卵母細胞和胚胎發(fā)育中具有十分重要的作用。有研究表明，玻璃化冷凍破壞了人[3]和牛[4]卵母細胞線粒體功能，降低了ATP含量，這可能是導致冷凍保存后卵母細胞發(fā)育能力低下的原因之一[4]。氧化應激和細胞凋亡也被認為是卵母細胞冷凍后活力下降的主要因素[5-6]。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ是一種特效作用于線粒體，通過降低線?；钚匝跛健p少氧化應激來保護線粒體功能的抗氧化劑[7]。目前，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ在豬卵母細胞冷凍保存應用方面未見相關報道。本試驗在豬卵母細胞凍后孵育液中添加MitoQ，研究線粒體膜電位、氧化應激水平、凋亡狀態(tài)、發(fā)育能力和相關基因表達水平，以期探討MitoQ對豬卵母細胞凍后發(fā)育的影響及可能的作用機理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

常規(guī)生化試劑除特別說明外均購自美國Sigma Aldrich公司，培養(yǎng)液購自美國Gilbco公司。

1.2 豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)

在屠宰場采集新鮮豬卵巢，置于含有青鏈霉素的37℃生理鹽水中，于2 h內運回實驗室。使用18號針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面直徑為2—6 mm的卵泡。在顯微鏡下選取胞質均勻且至少有3層完整顆粒細胞包圍的卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。COCs首先用臺式液清洗3次，再用TCM-199洗3次，然后置于四孔板中培養(yǎng)44 h。每60枚COCs置于500 μL體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，體外成熟培養(yǎng)液為TCM-199加10%豬卵泡液(實驗室自制)，加入10 IUmL孕馬血清促性腺激素(寧波第三激素制品有限公司)，10%胎牛血清，10 IUmL雙抗，0.1 mgmL L-半胱氨酸和10 ngmL表皮生長因子。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2及飽和濕度。成熟培養(yǎng)44 h后用0.1%透明質酸酶消化，選擇形態(tài)均一且排出第一極體的豬卵母細胞用于冷凍保存。

1.3 玻璃化冷凍和解凍

豬卵母細胞的玻璃化冷凍和解凍均在38.5℃的熱臺上進行，具體方法參考吳彩鳳等[8]。先將豬卵母細胞在冷凍保護液I[7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲基亞砜(DMSO)+10%胎牛血清(FBS)]中平衡處理3—5 min，然后移入冷凍保護液II(17%EG+17%DMSO+10%FBS+0.4 molL蔗糖)中， 平衡15—20 s后用OPS裝載，并迅速投入液氮中保存。解凍時，將OPS管中的細胞置于含有0.5 mmolL蔗糖的培養(yǎng)液中平衡3—5 min，然后轉入含0.25 mmolL蔗糖的培養(yǎng)液中繼續(xù)平衡3—5 min，TCM-199洗3次。解凍后的對照組為在含有10%FBS的TCM-199孵育液中孵育2 h；MitoQ處理組為在含有200 nmolL MitoQ的孵育液中孵育2 h。

1.4 豬卵母細胞凍后存活率和孤雌發(fā)育能力的測定

豬卵母細胞凍后存活率采用FDA染色方法測定。將各處理組的卵母細胞置于5 mgmL FDA染色中38.5℃染色5 min，洗滌后于熒光顯微鏡(LSCM，Nikon，日本)下觀察拍照，發(fā)強綠色熒光視為存活。豬卵母細胞凍后體外發(fā)育能力采用孤雌激活法測定。處理好的豬卵母細胞在電激活液中洗3次，移入鋪滿激活液的激活槽，均勻排列，以1.2 kVcm的直流電壓激活30 μs。激活后的豬卵母細胞在PZM-3中洗3次，然后置于38.5℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別在第2 天和第7天檢測卵裂率和囊胚率。

1.5 線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位ΔΨm檢測采用JC-1試劑盒(碧云天生物技術公司)。豬卵母細胞在JC-1染液(含800 μL TCM-199和200 μL 5×染色液緩沖液)中避光38.5℃孵育20 min，染色緩沖液洗3次(保持染色緩沖液4℃)后置于共聚焦顯微鏡(LSCM，Nikon，日本)下觀察拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化，分別記錄綠色和紅色熒光信號強度，各豬卵母細胞紅色(RITC)和綠色(FITC)熒光強度的比值即為ΔΨm。

1.6 凋亡早期檢測

使用Annexin V-FITC試劑盒(碧云天生物技術有限公司)對豬卵母細胞進行檢測。處理后的豬卵母細胞用TCM-199洗3次，然后移入195 μL Annexin V-FITC結合液和5 μL Annexin V-FITC染液的混合液中，室溫避光孵育10 min后移入190 μL Annexin V-FITC結合液和10 μL碘化丙啶染色液混合液中，冰浴避光10 min。TCM-199洗3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 活性氧(ROS)檢測

采用活性氧檢測試劑盒檢測。處理好的豬卵母細胞移入含有10 μmolL DCFH-DA的TCM-199中，在37℃培養(yǎng)箱內孵育20 min。用TCM-199洗3次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image-Pro Plus 6.0分析熒光強度。

1.8 脂質氧化檢測(MDA)

采用脂質氧化(MDA)試劑盒(碧云天生物技術有限公司)進行檢測。處理好的豬卵母細胞加入150 μL細胞裂解液，待裂解后，1 600g離心10 min，取100 μL上清加入到含有事先配好的200 μL MDA檢測工作液的離心管中，混勻后沸水浴加熱15 min，水浴冷卻至室溫，1 000g離心10 min。取200 μL上清加入到96孔板中，用酶標儀在532 nm處測定吸光度。MDA值以μmolmg表示。

1.9 Pan-Caspase染色

Pan-Caspase原位熒光染色采用Promega(美國)公司試劑盒。將FITC-VAD-FMK用TCM-199 以1∶500稀釋配成染色液，處理好的豬卵母細胞置于染色液中孵育20 min，TCM-199洗3次，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化，分析熒光強度值。

1.10 凋亡相關基因表達檢測

用一步法cDNA提取試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)提取試驗組和對照組豬卵母細胞(各240枚)的cDNA。參考NCB I中豬卵母細胞凋亡相關基因的cDNA序列設計引物，以GADPH為內參基因。引物信息見表1，用SYBR Green I進行熒光定量Real-time PCR。按TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)說明書配制20 μL反應體系：1 μL cDNA模板，0.4 μL Forward Primer(10 μmolL)，0.4 μL Reverse Primer(10 μmolL)，10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，8.2 μL ddH2O。反應程序為94℃ 30s；94℃ 5 s，60℃(參照各引物最佳退火溫度而定)30 s，45個循環(huán)。所有樣品均3次重復。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算比較。

表1 qRT-PCR所用引物信息

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以“平均數(shù)±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 凍后MitoQ處理對豬卵母細胞線粒體膜電位和凋亡水平的影響

凍后MitoQ處理組線粒體膜電位(0.66±0.06)與凍后對照組線粒體膜電位(0.47±0.05)相比顯著升高，表明MitoQ處理能提高凍后豬卵母細胞線粒體功能。MitoQ處理后豬卵母細胞早期凋亡比率(43.00±3.51%)和總Caspase熒光強度值(5.88±0.27)與對照組(55.33±1.45和8.03±0.51)相比顯著降低，表明MitoQ處理降低了冷凍后豬卵母細胞的凋亡水平。

圖1中紅色熒光與綠色熒光比值為線粒體膜電位，橙色熒光強度越高表示線粒體膜電位越高，MitoQ組復合通道下熒光強度高于對照組。圖2中卵母細胞呈綠色熒光，表明細胞發(fā)生早期凋亡，冷凍后2個組均出現(xiàn)大量早期凋亡豬卵母細胞， MitoQ處理后凋亡下降明顯。圖3中熒光強度越高表示Pan-Caspase活性越高，MitoQ處理組豬卵母細胞熒光強度值顯著下降。以上結果表明，冷凍后豬卵母細胞進行MitoQ處理提高了其線粒體功能，降低了其凋亡比例。

2.2 凍后MitoQ處理對豬卵母細胞氧化應激水平的影響

凍后MitoQ處理組豬卵母細胞的ROS水平(3.03±0.61)與對照組ROS水平(13.13±1.52)相比顯著降低；MitoQ處理豬卵母細胞的MDA含量(20.54±0.91)與對照組(26.78±0.54)相比亦顯著降低。由圖4可見，活性氧(ROS)含量與綠色熒光正相關，凍后MitoQ處理組的綠色熒光強度顯著低于對照組。上述結果表明，凍后豬卵母細胞孵育液中添加MitoQ可顯著降低細胞氧化應激水平。

2.3 凍后MitoQ處理對豬卵母細胞存活和體外發(fā)育的影響

凍后MitoQ處理組豬卵母細胞的存活率(60.33%±1.86%)、卵裂率(28.82%±1.38%)、囊胚率(4.50%±0.48%)與對照組的存活率(47.67%±1.67%)、卵裂率(22.07%±1.07%)、囊胚率(2.20%±0.51%)相比均顯著提高，表明凍后MitoQ處理能顯著提高豬卵母細胞的體外發(fā)育能力。

2.4 線粒體功能和凋亡相關基因表達

如圖5所示，凍后添加MitoQ處理的豬卵母細胞與對照組相比，線粒體氧化應激相關基因CuZnSOD相對表達量顯著提升；線粒體功能相關基因Mfn2相對表達量顯著提升，DNM1相對表達量顯著下降；凋亡相關基因TNF-α、Bax相對表達量顯著下降，Bcl-2相對表達量顯著升高，表明凍后MitoQ處理能調控豬卵母細胞線粒體功能和凋亡相關基因的表達。

3 討論

哺乳動物卵母細胞和早期胚胎中，線粒體作為極其重要的細胞器不僅產(chǎn)生ATP，還參與著許多重要的功能，如通過調控Ca2+、活性氧水平以及誘導細胞凋亡等，從而影響卵母細胞的發(fā)育能力[9]。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ是由三苯基磷酸陽離子與輔酶Q10的苯醌部分通過一個十碳脂肪鏈共價結合而成，能夠通過降低線粒體氧化損傷保護線粒體，從而降低細胞氧化應激水平，抑制細胞凋亡[10]。在帕金森病模型中，MitoQ可提高神經(jīng)細胞的線粒體功能[7]。在人精子冷凍方面，劉麗等[11]發(fā)現(xiàn)MitoQ處理可改善精子氧化應激水平，提高精子活力。本試驗在豬卵母細胞冷凍保存后孵育過程中添加200 nmolL MitoQ，顯著提高了其凍后存活率和孤雌激活胚胎的發(fā)育能力，與上述研究相似。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的標志性現(xiàn)象之一，膜電位下降，線粒體的功能受到影響。線粒體在凋亡相關信號引導下，膜通透性轉換孔(PTP)開放，釋放不同促凋亡因子，凋亡因子能夠活化凋亡蛋白酶Caspase，激活后的Caspase能夠促進更多的凋亡因子活化，通過級聯(lián)反應啟動凋亡程序。因此，線粒體膜電位和總Caspase熒光染色常被用于檢測細胞凋亡水平。磷脂酰絲氨酸(PS)正常情況下分布在細胞膜內側，在細胞早期凋亡時會由內側轉移至外側，裸露在細胞膜表面，常用Annexin V-FITC進行早期凋亡檢測。本試驗表明，豬卵母細胞凍后MitoQ處理提高了線粒體膜電位水平，降低了Caspase活性和早期凋亡現(xiàn)象。這與Wani等[12]用MitoQ在小鼠腦組織中改善細胞凋亡水平的結果類似，也與Sun等[13]在肝癌細胞中的研究結果一致。

細胞冷凍后受到氧化損傷，細胞內生成大量的ROS是主要的氧化應激損傷原因[14]。細胞內活性氧的產(chǎn)生和清除正常情況下保持動態(tài)平衡，ROS過多時就會產(chǎn)生氧化應激，氧化應激使得細胞處于易損狀態(tài)，并且能夠產(chǎn)生過量的脂質過氧化產(chǎn)物MDA，破壞生物膜和細胞的正常功能，降低酶活性，誘導細胞大分子(脂質、蛋白質和DNA)氧化變性，抑制蛋白質功能，促進細胞凋亡[15]。本試驗表明，凍后豬卵母細胞添加200 nmolL MitoQ能夠明顯降低細胞內ROS水平，減少MDA形成，該結果與Kelso等[16]用MitoQ降低大鼠肝細胞氧化應激水平的結果類似。這表明MitoQ能夠有效降低豬卵母細胞凍后氧化應激水平，減少氧化應激損傷。

冷凍損傷主要體現(xiàn)在對線粒體功能造成負面影響，并且啟動相關凋亡程序，線粒體受到損傷能夠誘導細胞線粒體途徑的凋亡[17]。本試驗中，添加200 nmolL MitoQ處理凍后卵母細胞，與對照組相比，促凋亡相關基因Bax、TNF-α顯著降低，抑制凋亡相關基因Bcl-2、CuZnSOD顯著升高，表明MitoQ能夠降低細胞凋亡水平，與Dai等[18]研究結果一致；線粒體融合蛋白Mfn2介導線粒體內外膜的融合，添加MitoQ能夠顯著提升Mfn2基因的相對表達量，降低線粒體分裂相關蛋白基因DNM1的表達水平，與謝南昌等[19]用線粒體分裂蛋白抑制劑來降低小膠質細胞凋亡和氧化損傷水平結果相符?？傊?，MitiQ可改善線粒體功能，降低細胞凋亡與氧化應激水平。

綜上，添加MitoQ處理凍后豬卵母細胞，能提高其線粒體功能，緩解細胞氧化損傷，降低細胞凋亡水平，從而起到促進卵母細胞凍后體外發(fā)育水平的效果。本研究揭示了MitoQ作為新型冷凍保護劑的可能性，為卵母細胞冷凍提供了新思路。