獼猴桃采后病害植物源殺菌劑的篩選及其抑菌效果分析

石 浩，王仁才，王 琰，何小娥，周 倩，卜范文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.園藝學(xué)院；b.植物保護學(xué)院；c.東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，湖南 常德 415100；3.湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125）

獼猴桃Actinidia chinensis被譽為“水果之王”，因其果實具有較為獨特的營養(yǎng)價值、藥用價值和較高的經(jīng)濟價值而頗受人們的喜愛[1]。近年來，獼猴桃產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，已成為當(dāng)今國內(nèi)外競相發(fā)展的新興高效高檔水果[2]。湖南全省的獼猴桃栽培面積達11 000 hm2，其產(chǎn)量達12.8萬t以上，已成為全國獼猴桃的主栽省區(qū)之一[3-4]。獼猴桃資源具有重要經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益，但其果實不耐貯運的特性已成為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因子[5]。獼猴桃果實采后易受真菌感染，從而極易軟化腐爛[6]。目前，許多研究者在軟腐的獼猴桃果實中鑒定出了青霉菌penicillum italicum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、間座殼菌Diaporthe、葡萄座腔菌Botryosphaeia dothidea和擬莖點霉菌phomopsis sp.等致腐病原菌，這些病菌可使其果實發(fā)病率達到20%以上[1,7-10]。因此，獼猴桃果實采收后，應(yīng)迅速采取有效措施以防腐保鮮。隨著人們生活水平的提高及食品安全意識的增強，許多以前使用效果較好但易產(chǎn)生有害物質(zhì)殘留和使病菌產(chǎn)生抗藥性的化學(xué)殺菌保鮮劑逐漸被淘汰甚至被禁用，因化學(xué)保鮮劑的不當(dāng)使用而引起的食品安全事故的頻發(fā)，使得人們對食品安全的訴求與日俱增，因此人們更加關(guān)注天然保鮮劑的研究與開發(fā)[11-13]。近年來的研究結(jié)果表明，植物有效成分在天然保鮮劑的開發(fā)和應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的前景。韓永萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，茶油復(fù)合物對櫻桃具有較好的保鮮效果；史振霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、丁香、桂皮復(fù)合中草藥提取劑對鴨梨具有較好的保鮮效果。利用天然植物提取物對產(chǎn)品進行貯藏防腐保鮮處理，這在許多園藝產(chǎn)品的貯藏保鮮研究方面已有報道，但有關(guān)天然植物提取物在獼猴桃鮮果保鮮中的應(yīng)用的研究報道卻較少。因此，以中草藥提取物應(yīng)用于獼猴桃果實防腐保鮮的試驗研究，對于獼猴桃的綠色安全貯藏及其產(chǎn)業(yè)化高效生產(chǎn)均有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物和菌種

供試植物共有120種，分別購于湖南九芝堂醫(yī)藥有限公司和湖南養(yǎng)天和大藥房，部分常見植物自行采摘，藥材名稱及用藥部位列于表1。供試菌種為葡萄座腔菌Botryosphaeia dothidea和間座殼菌Diaporthe，均由植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室課題組自行分離鑒定所得。

1.1.2 試劑與儀器

所用試劑：3%的中生菌素800倍液、20%的噻菌銅600倍液、10%的多抗霉素800倍液，均為江西禾益化工股份有限公司生產(chǎn)；納他霉素，由友康恒業(yè)生物科技公司生產(chǎn)。葡萄糖、瓊脂粉、丙酮、葡萄糖，均為中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)。

儀器設(shè)備：GZ-400-GII恒溫光照培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；DSZ2000X倒置生物顯微鏡，北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司；HVA-85滅菌鍋，上海申安科技有限公司；DHG-9146A干燥箱，上海申安科技有限公司；LC-10N-50A臺式冷凍干燥儀，力辰科技有限公司；PHS-25型PH計，上海儀電控股（集團）公司。

表1 供試植物名稱及用藥部位Table 1 Name and application positions of tested plants

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取液的制備

將上述植物樣本經(jīng)烘干后打粉過100目篩。取10 g植物粉末置于錐形瓶中，同時移取50 mL丙酮置于錐形瓶中，用保鮮膜封口，以150 r/min的轉(zhuǎn)速室溫振蕩12 h后，超聲提取0.5 h，抽濾得濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至10 mL以下后用10 mL的容量瓶定容，得到1.0 g/mL的提取液，于4 ℃條件下冷藏以備用。另取部分肉桂、黃芩、丁香提取液濃縮干燥至粉末，于4 ℃條件下冷藏以備用。

1.2.2 菌液的制備

取直徑約5 cm、已活化的菌塊接種于土豆培養(yǎng)基上，再將其放在培養(yǎng)箱中，在28 ℃條件下避光培養(yǎng)1周后，取新生長菌落置于離心管中，然后在離心管中加入1 mL 2%的吐溫80和3 mL 0.9%的生理鹽水。用玻璃棒攪拌打碎，將菌孢子懸浮液控制在105～106cfu/mL，于4 ℃條件下保藏以備用。

1.2.3 提取液抑菌活性的測定

采用牛津杯法測菌抑制率[16]。在PDA培養(yǎng)基上加入0.5 mL的菌懸浮液，用小毛刷涂勻。取3個 牛津杯等距插入培養(yǎng)皿中，移取200 μL植物提取液（0.22 μm機膜過濾）于牛津杯中。在28 ℃條件下避光培養(yǎng)96 h后測定抑菌圈的直徑。以丙酮作為空白對照，同時以3%的中生菌素800倍液、20%的噻菌銅600倍液、10%的多抗霉素800倍液、80 μg/mL的納他霉素作為陽性對照。

1.2.4 最低抑菌濃度的測定

制備含有濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL的提取物的PDA培養(yǎng)基，取0.3 mL的上述孢子懸浮液于培養(yǎng)基上，用小毛刷涂勻。在28 ℃的培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況。

1.2.5 最低殺菌濃度的測定

制備含有濃度分別為62.5、125、250、500 mg/mL的提取物的PDA培養(yǎng)基后，按照1.2.4中說明的方法進行試驗，觀察病原菌的生長狀況。

1.2.6 黃芩、肉桂、丁香提取物對菌絲生長量的影響試驗

由于肉桂、丁香提取物具有非常強的抑菌效果，黃芩也具有較強的抑菌效果，同時它們分別含有大量的揮發(fā)油類和黃酮類物質(zhì)，為給后期復(fù)配物的抑菌試驗打下基礎(chǔ)，故而對這3種植物提取物進一步進行了抑菌驗證試驗。取PDA液體培養(yǎng)基30 mL置入錐形瓶中，加入孢子懸浮液1 mL，在28 ℃的條件下振蕩培養(yǎng)，待長出菌絲球后再加入最終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的黃芩、肉桂、丁香提取物，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，將菌絲體過濾后干燥處理并稱重，重復(fù)3次。

1.2.7 黃芩、肉桂、丁香提取物對獼猴桃果實發(fā)病率的影響試驗

取健康獼猴桃果實，用接種針戳出2～3 mm的孔，每個果實戳孔5個。配置濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的提取液（含混合孢子106個/mL），取上述提取液10 μL涂于果實戳孔處。在溫度為28 ℃、相對濕度為90%的條件下貯藏1周。統(tǒng)計各處理果實的發(fā)病率。

每組發(fā)病率(%)=(每組發(fā)病的傷口數(shù)/每組發(fā)病的總傷口數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取液對菌體的抑制效果

丁香、肉桂、零陵香、黃芩、油茶餅粕、廣藿香、菖蒲、迷迭香、黃連、鳳仙透骨草、山蒼子等植物的丙酮提取液具有較強的抑菌效果，其抑菌效果見表2。由表2可知，其抑菌圈的直徑均在15 mm以上，可能因為這些植物的提取液中具有較多的芳香油類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，故可有效殺滅間座殼菌和葡萄座腔菌這兩類真菌[17]。同時，細辛、葡萄籽、川芎、苦楝、毛蕨、苦參、海金沙、大黃、麻黃根、孜然、皂角刺、荊芥、獨活、杜仲、五加皮等植物丙酮提取液的抑菌效果也都較好，其抑菌圈直徑均在10 mm 以上，可能因為這些植物的提取液中含有較多的生物堿、醌類、多酚、皂苷類物質(zhì)，從而能有效殺滅或抑制這兩種真菌[18]。

2.2 植物提取液對菌體的最低抑制和殺滅濃度

不同植物的丙酮提取液對葡萄座腔菌和間座殼菌的最低抑菌和殺菌濃度見表3。由表3可知，丁香和肉桂的抑菌效果最好，最低抑菌濃度非常低，僅為3.125 mg/mL；其次分別為廣藿香、細辛、黃 苓、荊芥、迷迭香、零陵香等物種，其最低抑菌濃度在10.00 mg/mL左右。這一結(jié)果表明了上述植物對葡萄座腔菌和間座殼菌均有較強的抑制作用。各種植物的最低殺菌濃度都比較高，而抑菌效果相對最好的丁香、肉桂等植物的提取液其殺菌濃度都達到了62.5 mg/mL，這可能因為植物中有效成分的單位含量較低或植物粗提物的抑菌效果不佳[19]。

2.3 黃芩、肉桂、丁香提取物對間座殼菌和葡萄座腔菌菌絲生長量的影響

2.3.1 黃芩、肉桂、丁香提取物對間座殼菌菌絲生長量的影響

黃芩、肉桂、丁香這3種植物的提取物對間座殼菌菌絲生長量的影響情況如圖1所示。由圖1可知，空白對照組的真菌在培養(yǎng)5 d后其菌絲的干質(zhì)量為0.82 mg，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的植物提取物后，菌絲生長量有所降低，且隨著提取物濃度的逐漸升高，菌絲生長的抑制現(xiàn)象越明顯。當(dāng)提取物的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，丁香、肉桂提取物處理組的菌絲干質(zhì)量相比于黃芩提取物處理組的菌絲干質(zhì)量（0.79 mg）均減少了10.50%以上。當(dāng)提取物的濃度為1.5 mg/mL時，丁香、肉桂提取物處理組的菌絲干質(zhì)量僅分別為0.11、0.10 mg。當(dāng)植物提取物的處理濃度達到2.0 mg/mL時，以這3種植物提取物處理的菌絲干質(zhì)量均在0.05 mg以下。

表2 不同植物丙酮提取液對葡萄座腔菌和間座殼菌的抑菌效果（96 h）Table 2 Inhibitory effects of plant acetone extracts on B.dothidea and Diaporthe (96 h)

表3 不同植物的丙酮提取液對葡萄座腔菌和間座殼菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentrations and minimum bactericidal concentrations of plant acetone extracts on B.dothidea and Diaporthe mg/mL

2.3.2 黃芩、肉桂、丁香提取物對葡萄座腔菌菌絲生長量的影響

黃芩、肉桂、丁香這3種植物的提取物對葡萄座腔菌菌絲生長量的影響情況如圖2所示。由圖2可知，空白對照組的真菌在培養(yǎng)5 d后其菌絲的干質(zhì)量為1.19 mg，隨著濃度的增加，提取物對菌絲生長的抑制能力逐漸增強，當(dāng)3種植物提取物的處理濃度為1.0 mg/mL時，其抑菌效果均不佳，菌絲的干質(zhì)量均仍在0.77 mg以上。當(dāng)其處理濃度達到1.5 mg/mL及以上時，相比于空白組，3種植物的提取物對菌絲生長量的影響均有較好的抑制效果，此時黃芩、丁香、肉桂提取物處理組的菌絲干質(zhì)量分別僅為0.48、0.33、0.28 mg。而當(dāng)其提取物的濃度達到2.0 mg/mL時，菌絲的干質(zhì)量均非常低，均已低于0.1 mg以下。

圖1 不同濃度的植物提取物對間座殼菌生長量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of plant extracts on increment of Diaporthe

圖2 不同濃度的植物提取物對葡萄座腔菌生長量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of plant extracts on increment of B.dothidea

2.4 黃芩、肉桂、丁香提取物對獼猴桃果實軟腐病發(fā)病率的影響

將供試的獼猴桃果實經(jīng)接種菌種后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，其果實的發(fā)病率如圖3所示。由圖3可知，空白對照組的果實發(fā)病率最高，達到了86%；隨著植物提取物濃度的增加，獼猴桃果實軟腐病的發(fā)病率呈下降趨勢，當(dāng)黃芩、肉桂、丁香提取物的濃度達到1.0 mg/mL及以上時，獼猴桃果實的發(fā)病率明顯降低，此3種植物提取物處理組的果實發(fā)病率均減少了25%以上。當(dāng)提取物的濃度增加到2.0 mg/mL時，此3種植物提取物處理組的果實發(fā)病率與對照之間相差37%左右，這一結(jié)果表明，此3種植物的提取物均可有效降低獼猴桃果實的發(fā)病率。

圖3 不同濃度的植物提取物對接種果實發(fā)病率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of plant extracts on incidences of inoculated fruits

3 討論與結(jié)論

獼猴桃果實軟腐常表現(xiàn)為生理自然軟化，也有由真菌感染所致的脅迫被動軟化的，防治獼猴桃快速軟腐的方法有很多種，其中最常用的方法是化學(xué)處理法，但化學(xué)處理常伴隨著試劑殘留，不利于果實的綠色貯藏，本研究采用120種中藥材提取物進行獼猴桃軟腐病菌（葡萄座腔菌、間座殼菌）的抑菌篩選試驗，結(jié)果表明，不同植物提取物的抑菌效果具有較大的差別，有些植物具有抑菌效果，而有些植物不具有抑菌效果，有些植物的抑菌效果好，而有些植物的抑菌效果差，還有些植物提取液對不同真菌的抑菌效果具有一定的選擇性，如烏蕨、苦楝、博落回、橘紅、樟樹葉等植物提取液并不會同時抑制兩種真菌。丁香、肉桂、零陵香、黃芩、油茶餅粕、廣藿香、菖蒲、迷迭香、黃連、鳳仙透骨草、山蒼子等植物提取物的抑菌效果均較好，而其對此兩種真菌的抑菌圈直徑均可達15 mm以上，其中丁香、肉桂、廣藿香、細辛、黃苓等中藥提取物的抑菌效果最佳，其最低抑菌濃度均在5 mg/mL左右，其最低殺菌濃度均在100 mg/mL左右。這些植物中都含有豐富的揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、皂苷等物質(zhì)，這些有效提取物破壞了真菌的細胞結(jié)構(gòu)、影響了細胞代謝和分化，從而抑制或殺滅真菌[20-22]。陸寬等[23]、曾志紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂、丁香丙酮提取物含有豐富的揮發(fā)油類物質(zhì)，對多種病原菌均有非常強的抑制作用，當(dāng)其濃度為3.125 mg/mL 時，提取物對枝孢霉菌便具有較強的殺滅作用，這與本研究所得的結(jié)果基本一致，說明這2種植物對真菌均有一定的廣譜殺菌作用。

本研究從120種中藥材中篩選出抑菌效果較好的藥材，并測定了不同濃度的提取物對間座殼菌和葡萄座腔菌的最低抑菌濃度與最低殺菌濃度，但其最低殺菌濃度比較高，由于中藥材提取物為粗提混合物，一方面可能因為其所含有效成分較少，另一方面可能因為粗提物中有些成分會影響到活性物質(zhì)的抑菌效果[25]，在后期試驗中可單獨對幾種或某種抑菌效果好的藥材提取物進行分離純化，以準確判定其主要抑菌物質(zhì)及其抑菌能力。本研究選取了肉桂、丁香、黃芩這3種中藥材，并測定了其提取物對2種真菌菌絲生長量的影響情況和抑制效果，采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)基中中藥濃度的增加，真菌菌絲的生長量則逐漸減少，說明3種中藥材對真菌的抑制能力逐漸增強，當(dāng)3種中藥材提取物的濃度達到2.0 mg/mL時，各處理組的間座殼菌菌絲的干質(zhì)量均在0.05 mg 以下，而葡萄座腔菌菌絲的干質(zhì)量均在0.1 mg以下。這一結(jié)果說明，這3種中藥材均有較強的抑菌能力，且其提取物均無毒、無異味，都是較好的天然防腐抑菌劑。以此3種中藥材提取物對供試的獼猴桃果實進行防腐處理，結(jié)果表明，丁香、肉桂處理組獼猴桃果實的發(fā)病率要略低于黃芩處理組，可能因為，前兩者一方面具有更強的抑菌效果，另一方面前兩者提取物中多為揮發(fā)油，其可有效防止果實水分蒸發(fā)枯萎。同時，3種中藥材提取物處理均可明顯減少果實的發(fā)病率，當(dāng)其處理濃度均達2.0 mg/mL時，果實發(fā)病率均減少了35%左右。這是因為，一方面提取物殺滅了軟腐菌，另一方面提取物對果實本身也有一定的防腐保鮮作用[26-27]。本研究目前僅處于試驗階段，后期的研究，應(yīng)在進一步改良植物提取物的配方的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于后期的獼猴桃商業(yè)化防腐處理中，以延長獼猴桃的貨架期，提高其經(jīng)濟價值，同時后期研究還應(yīng)進一步揭示其抑菌機理，以驗證和弄清植物提取物作用于獼猴桃類腐生菌后真菌死亡的原因。