不同無性系白果的毒性和營養(yǎng)分析

胡亞平，米月穎，郭起榮，蔡金峰

（南京林業(yè)大學(xué) a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.林學(xué)院；c.江蘇省種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)銀杏種質(zhì)圃，江蘇 南京 210037）

長久以來，白果（Ginkgo bilobaseed）被作為一種“藥食兩用”的資源，最早記錄出現(xiàn)在元朝的《日用本草》中[1]。《中國藥典》（2015版）中描述其為性味甘苦澀，歸肺經(jīng)，具有斂肺定喘，止帶縮尿之功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，白果中富含多種活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化性[3]、抗腫瘤[4]和治療心腦血管等疾病的功效[5]。目前，國內(nèi)大部分白果資源供食用，市場上有各種白果制成品出售，白果也被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)收錄于食藥兩用中藥品種目錄中。

雖然白果藥物利用價(jià)值高，藥用療效明顯，但是白果中含有多種有毒成分，影響著白果資源的有效利用，制約白果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。有研究表明，白果中含有的多種致毒成分會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)間歇性痙攣、嘔吐、全身性驚厥等中毒癥狀，嚴(yán)重的甚至造成死亡。白果中毒事件屢有報(bào)道，但多發(fā)于抵抗力較弱的孩童和老人群體[6]。《本草綱目》中記載“食多則收令太過，令人氣壅臚脹昏頓”。1985年，日本科學(xué)家首次在白果中提取出4'-O-甲基吡哆醇（4'-O-methylpyridoxine，MPN），并證實(shí)MPN即白果中的主要致毒物質(zhì)[7]。2000年，Scott等第1次在白果中檢測出4'-O-甲基吡哆醇-5'-葡萄糖苷（MPN-5'-glucoside，MPNG）[8]；2011年，Kobayashi等在白果果仁中檢測出MPN的糖基轉(zhuǎn)化物，即MPNG，而且MPNG同樣具有致毒作用，但其毒性小于MPN?？蒲腥藛T把白果中的MPN和MPNG合稱“銀杏毒”（ginkgotoxin）[9]（圖1）。有研究表明，熟白果和生白果中的主要致毒物質(zhì)不同，生白果中主要為MPN，熟白果中主要為MPNG，但是生、熟白果中銀杏毒的總量不變，說明加熱熟化可以促進(jìn)MPN轉(zhuǎn)化為MPNG[10]。白果脫毒一直是白果產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的一大技術(shù)難題。

圖1 銀杏毒成分結(jié)構(gòu)化學(xué)式Fig.1 Structural chemical formula of ginkgotoxin

中國白果資源豐富，擁有世界70%左右的銀杏資源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國年產(chǎn)白果約19萬t，主要產(chǎn)區(qū)為江蘇、山東、湖北、四川、陜西和安徽等省份[11]，白果產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮蟆０坠摱炯夹g(shù)尚未成熟，甄別來自不同產(chǎn)區(qū)無性系白果的營養(yǎng)和毒素含量，有利于白果產(chǎn)區(qū)調(diào)整種源結(jié)構(gòu)，提升白果整體質(zhì)量，可為白果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

39個(gè)無性系白果均來自中國江蘇省徐州市邳州國家銀杏良種基地。20世紀(jì)90年代，以采集自全國各地及日本的優(yōu)良母株枝條作為接穗，以2～3 m高的5 a實(shí)生幼樹作為砧木，起始嫁接部位樹干離地1.8～2.0 m處，每株砧木嫁接3～4根接穗，每個(gè)無性系嫁接6株?，F(xiàn)各植株長勢良好，結(jié)實(shí)正常。參試的39個(gè)無性系白果編號(hào)和母株原產(chǎn)地見表1。2018年10月，選取各種源長勢中庸的一棵采集種實(shí)，去除外種皮，測量果實(shí)形態(tài)指標(biāo)后，取出胚乳，-60 ℃低溫凍干，研磨粉碎后過50目篩，備用。

表1 參試39個(gè)白果無性系的名稱和來源Table 1 Names and origins of 39 G.biloba clones

1.2 主要儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)，購于美國Labconco公司；Waters arc二元高效液相色譜儀、SinoChrom ODS-BP色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），購于美國Waters公司；Millipore-Q超純水制備儀；CAAM-2001多功能原子吸收光譜儀，購于北京瀚時(shí)制作所。

1.3 測定方法

1.3.1 果實(shí)形態(tài)指標(biāo)

各無性系選取50顆白果，用游標(biāo)卡尺測量白果的縱徑和橫徑，然后取出胚乳凍干并稱重。果形指數(shù)為縱徑和橫徑的比值。

1.3.2 果實(shí)銀杏毒含量

參考McAlpine等[12]的檢測方法，采用高效液相色譜法檢測白果中的銀杏毒含量。

白果粉水提液的制備：稱取0.5 g干燥白果粉，加入20 mL超純水，震蕩120 min，10 000 r/min離心10 min后收集上清液，重復(fù)2次。2次收集的上清液過0.22 μm濾膜后，定容至50 mL，備用。

液相色譜條件：流動(dòng)相A為含5 mmol/L戊烷磺酸鈉的5 mmol/L磷酸鉀溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5；流動(dòng)相B為乙腈。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL，保留時(shí)間40 min，流速1 mL/min。檢測條件為熒光發(fā)射波長395 nm，激發(fā)波長295 nm。梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 白果粉水提液液相色譜檢測的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution process of water extract of G.biloba seed powder in detection of liquid chromatography %

1.3.3 果實(shí)營養(yǎng)元素含量

采用原子吸收光譜法測定白果中K、Ca和Mg營養(yǎng)元素含量。取0.5 g干燥粉樣置于凱氏燒瓶中，加入硝酸-高氯酸混合液10 mL，瓶口放置1個(gè)小漏斗，消煮時(shí)可減少蒸發(fā)，置于調(diào)溫電爐上消煮，控制溫度，使消煮液保持微沸。此時(shí)發(fā)生大量的二氧化氮棕色氣體，當(dāng)液體透明且無糊狀時(shí)消煮完畢。將消煮完畢的待測液冷卻后，定容至50 mL。使用原子吸收光譜儀測定待測液的K、Ca、Mg含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2016和ChemSketch 10進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 各無性系白果形態(tài)指標(biāo)的比較

各無性系白果果形指數(shù)和百粒胚乳質(zhì)量見 表3。由表3可知，不同無性系白果果形差異顯著，2號(hào)和14號(hào)無性系白果最接近圓形，37號(hào)和38號(hào)無性系白果最狹長。各無性系白果的形態(tài)如圖2所示，縱徑和橫徑分布如圖3所示。根據(jù)銀杏核用品種分類，長寬比大于1.75的為長子品種；在1.50～1.75的為佛指品種；在1.30～1.50的為中指品種；小于1.30的為圓子品種[13]。本研究中參試39個(gè)無性系白果果形指數(shù)為1.16～1.81，覆蓋了白果的4個(gè)類群，基本包括了主要白果產(chǎn)區(qū)的果實(shí)特性。白果胚乳質(zhì)量與果形指數(shù)未表現(xiàn)出明顯的線性相關(guān)性，無顯著的相關(guān)性。2號(hào)無性系白果果形指數(shù)最小，為1.18±0.05，百粒胚乳質(zhì)量為(43.85±0.06) g；37號(hào)無性系白果果形指數(shù)最大，為1.81±0.08，百粒胚乳質(zhì)量為(56.75±0.05) g；29號(hào)無性系白果果形指數(shù)介于兩者之間，為1.29±0.05，但是其百粒胚乳質(zhì)量達(dá)到了(99.89±0.08) g，在各無性系白果中其胚乳質(zhì)量最大。這可能與不同無性系白果胚乳和中種皮之間的空隙不同有關(guān)。

表3 各無性系白果果形指數(shù)和百粒胚乳質(zhì)量?Table 3 Shape indexes and 100-seed endosperm masses of different clones of G.biloba seeds

圖2 各無性系白果的形態(tài)Fig.2 Seed shapes of different G.biloba clones

圖3 各無性系白果的縱徑和橫徑分布Fig.3 Distribution of longitudinal and transverse diameters of different clones of G.biloba seeds

2.2 各無性系白果銀杏毒含量的比較

白果中銀杏毒成分主要分布在胚乳中。39個(gè)無性系白果胚乳中MPN平均含量為360.75 μg/g，MPNG平均含量為46.45 μg/g，各無性系白果銀杏毒含量見表4。其中，MPN含量最高的是37號(hào)無性系，平均含量為(485.24±0.45) μg/g；含量最低的為39號(hào)無性系，平均含量為(247.44±0.41) μg/g，均與其他無性系具有顯著差異（P＜0.05）。MPNG含量最高的是39號(hào)無性系，平均含量為(213.03±0.21) μg/g，遠(yuǎn)高于整體平均值，與其他無性系有顯著差異；含量最低的為32號(hào)無性系，平均含量為(21.43±0.48) μg/g。

基于各無性系白果銀杏毒含量，采用類平均法對其進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，39個(gè)無性系可分成4類。4號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、16號(hào)和27號(hào)無性系為一類，其平均MPN含量為309.67 μg/g，MPNG含量為38.40 μg/g，銀杏毒含量為348.07 μg/g。1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、17號(hào)和37號(hào)無性系為一類，其平均MPN含量為441.88 μg/g，MPNG含量為 48.00 μg/g，銀杏毒含量為489.88 μg/g。19號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、22號(hào)、24號(hào)、26號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、33號(hào)、34號(hào)和39號(hào)無性系為一類，其平均MPN含量為356.99 μg/g，MPNG含量為68.63 μg/g，銀 杏毒含量為425.62 μg/g。其余無性系為一類，其平均MPN含量為347.69 μg/g，MPNG含量為41.06 μg/g，銀杏毒含量為385.75 μg/g。

表4 各無性系白果銀杏毒含量 Table 4 Ginkgotoxin contents in different clones of G.biloba seeds μg/g

2.3 各無性系白果營養(yǎng)元素含量的比較

白果藥食兩用，其營養(yǎng)元素含量豐富。各無性系白果營養(yǎng)元素含量見表5。由表5可知，39個(gè)無性系白果中，K、Ca和Mg平均含量為(0.60±0.04)、(0.19±0.02)、(0.48±0.01) mg/g，略高于食用板栗的含量。不同無性系白果K、Ca和Mg營養(yǎng)元素的含量較為相近。

圖4 基于白果銀杏毒含量的參試無性系聚類結(jié)果Fig.4 Cluster results of tested clones base on ginkgotoxin contents in G.biloba seeds

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同無性系白果果形和銀杏毒含量差異顯著，白果果形指數(shù)為1.16～1.81。銀杏毒總量最高為525.79 μg/g，總量最低為330 μg/g。其中MPN含量最高為485.24 μg/g，含量最低為247.44 μg/g；MPNG含量最高為213.03 μg/g，含量最低為21.43 μg/g。根據(jù)白果總銀杏毒含量對各無性系進(jìn)行系統(tǒng)聚類，39個(gè)無性系白果可以分為4類。不同無性系白果的營養(yǎng)元素含量較為接近。

銀杏是孑遺物種，極少出現(xiàn)形態(tài)分化，各品種之間形態(tài)差異較小，品種鑒別困難，尤其是銀杏苗期的品種鑒定[14]。但是不同品種的白果外形差異較為明顯，可以作為判斷的依據(jù)之一。與被子植物相比，大多數(shù)裸子植物的質(zhì)體DNA表現(xiàn)為父系遺傳，本研究結(jié)果顯示白果果形是以母系遺傳為主。白果中種皮與胚乳之間靠近種柄端具有一層空腔，根據(jù)本研究結(jié)果，體積大的白果胚乳質(zhì)量不一定大，說明白果空腔體積不能簡單依據(jù)白果體積來判斷?？涨坏陌l(fā)育過程和作用有待進(jìn)一步探討。

MPN與維生素B6具有相似結(jié)構(gòu)，MPN進(jìn)入人體后會(huì)與維生素B6產(chǎn)生拮抗作用，導(dǎo)致人體維生素B6含量顯著下降，可能出現(xiàn)抽搐驚厥、昏迷甚至死亡等癥狀[15]，所以生白果比熟白果具有更高的毒性，因此不建議生食白果。白果中致毒物質(zhì)除銀杏毒外，還有氫氰酸[16]、致敏蛋白[17]、銀杏酚酸[18]等物質(zhì)。已有關(guān)于不同致毒物質(zhì)的毒性藥理研究的大量報(bào)道[19]，部分有毒重要成分經(jīng)過合理的結(jié)構(gòu)修飾，可以轉(zhuǎn)化為無毒成分，起到減毒增效的作用。但目前仍缺乏一套科學(xué)、有效、經(jīng)濟(jì)的脫毒工藝。以傳統(tǒng)中藥炮制、配伍減毒方法為基礎(chǔ)，結(jié)合新型減毒方法的同時(shí)，借鑒并吸收農(nóng)副產(chǎn)品中的脫毒手段，合理利用生物技術(shù)，探索并開發(fā)新型的白果減毒工藝，應(yīng)用到白果加工和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，對白果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

表5 各無性系白果營養(yǎng)元素含量 Table 5 Nutrient contents in different clones of G.biloba seeds mg/g

白果雖有毒，但是也含有豐富的營養(yǎng)成分。除含有蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉和糖類外，白果還含有豐富的有益于身體健康的卵磷脂、維生素、微量元素和重要的氨基酸[20-22]。本研究中各無性系白果生長環(huán)境一致，可能是導(dǎo)致不同無性系白果中各營養(yǎng)元素含量差異不顯著的原因之一。能否通過改善種植條件和技術(shù)手段來提升不同無性系白果的營養(yǎng)價(jià)值，須在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行驗(yàn)證。白果成熟后銀杏毒含量與儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系，白果脫毒新工藝，及白果不同毒性物質(zhì)間是否具有協(xié)同或者拮抗作用均有待深入探討。