常振策，李忠旬，修江帆，盧成，賈利娜，國果,2，吳建偉,2***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)?，F(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

家蠅(Muscadomestica)攜帶多種病原體后仍能正常生存和繁殖，得益于其強大的先天免疫系統(tǒng)[1-4]，因此，家蠅可作為先天免疫研究的理想模型[5-6]。近年來，家蠅的免疫相關(guān)功能基因的生物學(xué)功能已經(jīng)成為研究熱點，核酸轉(zhuǎn)錄水平分析其表達(dá)模式是研究功能基因的第一步。Clip-絲氨酸蛋白酶超家族屬于非消化性蛋白酶家族，參與昆蟲的先天免疫和生長發(fā)育[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-絲氨酸蛋白酶基因(clip-serine protease gene ofmuscadomestica,Clip-Msp)表達(dá)水平增高，認(rèn)為該基因與家蠅抗C.albicans感染相關(guān)[8]。目前，家蠅Clip-絲氨酸蛋白酶基因克隆表達(dá)報道甚少，也未見家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-絲氨酸蛋白酶基因時空表達(dá)的相關(guān)研究。為了初步探索Clip-Msp基因在家蠅抗C.albicans感染過程中的免疫功能，本研究通過克隆家蠅Clip-Msp基因，并分析Clip-Msp基因在C.albicans刺激家蠅幼蟲后的時空表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究Clip-Msp基因的分子功能和家蠅的免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物、質(zhì)粒和菌株 家蠅(Muscadomestica)三齡幼蟲為本課題組飼養(yǎng)，克隆感受態(tài)E.coliDH5α購自北京全式金公司，克隆載體pMD19-T購自Takara公司。

1.1.2主要試劑及儀器 Trizol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、基因克隆相關(guān)試劑、氨芐青霉素、SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒均購自Takara公司，固相RNase清除劑和組織RNA保存液均購自Solarbio公司。使用儀器有核酸凝膠電泳裝置及成像系統(tǒng)，顯微超微量注射儀，ABI PRISM 7300，Nanodrop2000。

1.2 方法

1.2.1pMD19-T/Clip-Msp克隆載體的構(gòu)建 按照Trizol說明書提取家蠅三齡幼蟲總RNA，然后以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為Clip-Msp基因克隆時PCR擴增的模板。42 ℃時2 min，冰浴5 min基因組中的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 20 min、85 ℃ 10 s、4 ℃ 10 s。在Primer 5.0上設(shè)計Clip-Msp基因的克隆引物(SkF、SkR)，由上海生工合成。Clip-Msp基因克隆上游引物(SkF)為ATGTATACAAAAATGCAAG，下游引物(SkR)為TCACTTTGAACCTTCGCCGCTATT。Clip-Msp基因PCR擴增的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠試劑盒純化回收，在16 ℃將純化的PCR產(chǎn)物和pMD19-T載體連接12～16 h，將pMD19-T/Clip-Msp轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α克隆感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2生物信息學(xué)分析 運用DNAMAN V6.0軟件分析Clip-Msp基因的開放閱讀框及氨基酸序列；在SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)網(wǎng)站上分析Clip-Msp蛋白信號肽位點，在TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)上分析Clip-Msp蛋白跨膜區(qū)，在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)上分析Clip-Msp蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.3Clip-Msp基因在家蠅幼蟲感染后的時空表達(dá) 在Oligo6.0上設(shè)計Clip-Msp和GAPDH基因的實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)引物，由上海生工合成。Clip-Msp基因熒光上游引物(SyF)為ATAGGGAAGGTAGAACGG，下游引物(SyR)為CATAACATCTCCACGGAAT；GAPDH基因熒光上游引物(NyF)為GTCGTATTGGCCGTTTGGTT，下游引物(NyR)為GGGTGGAGTCGAATTTGAACA。取家蠅三齡幼蟲分為2組，一組顯微注射0.21 μL 1×1013cfu/L 0.21 μL的白假絲酵母菌，作為感染組；另一組注射等體積的PBS緩沖液，作為對照組。收集感染組和對照組不同作用時點(3、12、24及48 h)的幼蟲組織(唾液腺、血淋巴、氣管、脂肪體、腸道、馬氏管、體壁)，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以各時間點組織的cDNA為模板，GAPDH基因為內(nèi)參照，采用Real-Time PCR檢測Clip-Msp表達(dá)，儀器為ABI PRISM 7300 (ABI,USA)。按照SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)說明書配制反應(yīng)體系，每個樣本做3個重復(fù)，實驗進(jìn)行3次。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、40個循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s。感染組Clip-MspmRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt計算，處理好的數(shù)據(jù)在Graphpad prism6上分析作圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pMD19-T/Clip-Msp克隆載體的構(gòu)建

家蠅三齡幼蟲總RNA電泳檢測可見：18S條帶較28S條帶明亮清晰，28S條帶暗淡模糊，說明提取的總RNA完整(圖1)。用Clip-Msp基因的克隆引物(SkF和SkR)對pMD19-T/Clip-Msp重組菌進(jìn)行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示,其PCR產(chǎn)物在1 524 bp左右有一特異性條帶，與預(yù)期的片段大小相一致，經(jīng)測序鑒定表明Clip-Msp基因的克隆載體構(gòu)建成功(圖2)。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為家蠅三齡幼蟲總RNA。圖1 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The integrity of total RNAs analyzed in agarose gel electrophoresis

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pMD19-T/Clip-Msp重組菌落PCR。圖2 pMD19-T/Clip-Msp重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Clip-Msp PCR product amplified from recombinant colony PCR of pMD19-T/Clip-Msp and analyzed in Agarose gel electrophoresis

2.2 生物信息學(xué)分析

結(jié)果顯示，Clip-Msp基因ORF長為1 524 bp，編碼507個氨基酸(圖3)。Clip-Msp蛋白的氨基酸序列中沒有信號肽(圖4)，N端第13～35位氨基酸為跨膜區(qū)，推測其為非經(jīng)典分泌型蛋白(圖5)。Clip-Msp蛋白的Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域為247～494位氨基酸，Clip結(jié)構(gòu)域為45～92位氨基酸，屬于單催化結(jié)構(gòu)域Clip-絲氨酸蛋白酶超家族(圖6)。

圖3 Clip-Msp基因的開放閱讀框及氨基酸序列Fig.3 Clip-Msp ORF and its the amino acid sequence

2.3 Clip-Msp基因的時空表達(dá)

感染組家蠅三齡幼蟲在感染白假絲酵母菌后后不同時間點、不同組織中Clip-Msp基因的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)；3 h時以血淋巴中表達(dá)量增加最高(圖7)，12 h時以脂肪體、氣管、唾液腺和腸道中表達(dá)量增加為主，脂肪體內(nèi)的相對表達(dá)量最高(圖8)；24 h時以腸道中表達(dá)最高，脂肪體次之(圖9)；48 h時以血淋巴中表達(dá)量最高，馬氏管和腸道次之(圖10)。提示Clip-Msp基因主要在血淋巴、脂肪體和腸道中表達(dá)。

3 討論

注：C值為剪切位點值，在剪切位點處C值最高；S值顯示變化趨勢，在信號肽區(qū)域S值較高；Y值為綜合考慮S值和C值的一個參數(shù)，剪切點通常在S值陡峭位置的高C值位點即Y-max推測。圖4 Clip-Msp蛋白的信號肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of Clip-Msp protein

注：Inside表示胞內(nèi)區(qū)，Outside表示胞外區(qū)，Transmembrane表示跨膜區(qū)；各自數(shù)值越大，表示某氨基酸位于對應(yīng)區(qū)域內(nèi)的可能性越大。圖5 Clip-Msp蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.5 Transmembrane analysis of Clip-Msp protein

圖6 Clip-Msp蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Conserved domain analysis of Clip-Msp protein

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與對照組比較，P<0.001。圖7 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后3 h時不同組織中Clip-Msp相對表達(dá)Fig.7 Relative mRNA expression levels of Clip-Msp in different tissues at 3 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.01；(3)與對照組比較，P<0.001。圖8 感染3日齡家蠅幼蟲后12 h不同組織中Clip-Msp相對表達(dá)Fig.8 Relative expression levels of Clip-Msp in different tissues ath 12 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與對照組比較，P<0.05；(3)與對照組比較，P<0.001。圖9 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后24 h不同組織中Clip-Msp相對表達(dá)Fig.9 Relative expression levels of Clip-Msp in different tissues at 24 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.001。圖10 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后48 h不同組織中Clip-Msp相對表達(dá)Fig.10 Relative mRNA expression levels of Clip-Msp in different tissues at 48 h after infection

昆蟲先天免疫(Insect innate immunity)是指當(dāng)外來病原體感染昆蟲時，機體通過自身的模式識別受體來識別病原相關(guān)分子模式，從而激活相關(guān)先天免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗菌肽等非特異性功能效應(yīng)分子清除病原體[9-12]。家蠅不僅是重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲[13-14]，也是先天免疫研究的理想模型[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-Msp基因表達(dá)量增高，認(rèn)為該基因與家蠅抗C.albicans感染相關(guān)[8]。通過生物信息學(xué)分析可知，Clip-Msp氨基酸序列中有一個Clip結(jié)構(gòu)域和Tryp_SPc(類胰蛋白酶結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)域，因此它屬于Clip-絲氨酸蛋白酶超家族。分泌型蛋白通常指的是在N端有信號肽，并且依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌到胞外的蛋白[15]。反之，那些不通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌到質(zhì)膜和胞外的蛋白為非經(jīng)典分泌型蛋白[16]。非經(jīng)典分泌途徑包括質(zhì)膜孔形成、基于膜結(jié)合細(xì)胞器、繞過高爾基體[17]。據(jù)報道，黑腹果蠅84個單結(jié)構(gòu)域的Clip-絲氨酸蛋白酶中，有12個缺乏典型的信號肽，為分泌型蛋白。分析黑腹果蠅Clip-絲氨酸蛋白酶發(fā)現(xiàn)：cSP44和cSP56以透膜區(qū)代替信號肽分泌到胞外為非經(jīng)典分泌型蛋白，cSP54和cSP229既無透膜區(qū)也無信號肽為非分泌型蛋白[18-20]。Clip-Msp的開放閱讀框無信號肽，具有透膜區(qū)，可能與黑腹果蠅cSP44和cSP56相似，是否以透膜區(qū)的非經(jīng)典方式分泌到胞外或其它途徑分泌至胞外有待進(jìn)一步研究。

Clip-Msp在白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后，總體上呈先升高后降低的趨勢。血淋巴Clip-Msp相對表達(dá)量在3 h和48 h較高，脂肪體Clip-Msp表達(dá)量在12 h和24 h較高，腸道Clip-Msp表達(dá)量在24 h達(dá)到最大值?？赡苁荂lip-Msp參與真菌免疫應(yīng)答不同時間點在不同組織中起作用所致。據(jù)報道，含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶通過昆蟲體液免疫中的水解級聯(lián)反應(yīng)，激活酚氧化酶系統(tǒng)，引發(fā)黑化反應(yīng)；參與Toll通路中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控抗菌肽的合成[21-22]。當(dāng)機體受到真菌感染后，Clip-絲氨酸蛋白酶前體通過自身的水解級聯(lián)反應(yīng)活化成為Clip-SPs，隨后激活血細(xì)胞內(nèi)的酚氧化酶原，參與血淋巴的黑化[21,23-24]。因此，感染初期(感染后3 h)Clip-Msp基因在血淋巴中表達(dá)量最高。隨著作用時間的增加，感染迅速向全身蔓延，Clip-Msp參與機體內(nèi)Toll免疫信號途徑的激活，抗真菌肽在脂肪體中合成[8,25-26]。因此，感染中期(感染后12-24 h)脂肪體中Clip-Msp的表達(dá)量最高。感染中后期(感染后24 h)，感染逐漸控制，但Clip-Msp在腸道中表達(dá)量最高，可能與增強腸道局部免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[27]。感染后期(感染后48 h)，白假絲酵母菌的數(shù)量減少，黑化現(xiàn)象逐漸減弱，為了防止機體過度免疫造成損傷，絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制了Clip-Msp的表達(dá)[28]。但血淋巴中表達(dá)量仍然很高，可能與白假絲酵母菌感染血淋巴導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)有關(guān)。在感染后檢測的7種組織中，以血淋巴、脂肪體和腸道的表達(dá)量增加最為明顯。推測Clip-Msp主要在血淋巴、脂肪體和腸道中表達(dá)。關(guān)于Clip-Msp在家蠅三齡幼蟲體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能，課題組將進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pMD19-T/Clip-Msp克隆載體，Clip-Msp基因開放閱讀框全長1 524 bp，共編碼507個氨基酸，無信號肽，存在跨膜區(qū)，屬于非經(jīng)典分泌型蛋白；Clip-Msp蛋白的N端存在一個Clip結(jié)構(gòu)域，C端有一個Tryp_SPc催化結(jié)構(gòu)域，屬于單催化結(jié)構(gòu)域Clip-絲氨酸蛋白酶超家族；白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后，Clip-Msp基因在不同時間點、不同組織中表達(dá)存在差異(P<0.05)，主要分布在家蠅三齡幼蟲的血淋巴、脂肪體和腸道中。