梅州地區(qū)柑橘黃龍病的常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用

李月 張志標(biāo) 周玉蓉 鐘進(jìn)良 馬瑞豐 劉蕊 黃城 陶星星

摘要? ? 本文利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)技術(shù)對(duì)梅州地區(qū)疑似柑橘黃龍病樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)PCR檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)柑橘黃龍病菌結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠且無污染。采用2種方法對(duì)梯度稀釋的陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度較常規(guī)PCR更高，能夠檢出樣品中痕量的病原菌。本研究在梅州地區(qū)建立了以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行柑橘黃龍病疑似植株的檢測(cè)，可以為梅州地區(qū)提供更準(zhǔn)確、更靈敏、快速的黃龍病檢測(cè)技術(shù)。

關(guān)鍵詞? ? 柑橘黃龍病;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;靈敏度;廣東梅州

中圖分類號(hào)? ? S664.4? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）08-0103-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? In this paper，TaqMan probe real-time quantitative PCR（qPCR）detection technology was used to detect suspected citrus huanglongb-ing samples in Meizhou area，and compared with conventional PCR detection.The results showed that real-time fluorescent quantitative PCR for detecting citrus huanglongbing was fast，accurate，reliable and free pollution.Two methods were used to detect the gradient-diluted positive samples，which showed that the sensitivity of real-time quantitative PCR was higher than that of conventional PCR，and it could detect trace amounts of pathogenic bacteria in the samples.This study established a real-time quantitative PCR method to detect suspected citrus Huanglongbing plants in Meizhou area，which could provide more accurate，sensitive and rapid Huanglongbing detection technology in Meizhou area.

Key words? ? citrus huanglongbing;real-time fluorescent quantitative PCR;sensitivity;Meizhou Guangdong

柑橘作為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，產(chǎn)量居于世界水果之首[1]。梅州市作為全國最大的柚類生產(chǎn)基地，生產(chǎn)區(qū)域覆蓋了所轄的梅江區(qū)、梅縣區(qū)、大埔縣、興寧市、五華縣等共65個(gè)鎮(zhèn)[2]。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，其病蟲害問題也接踵而至，其中最為嚴(yán)重的是柑橘黃龍?。╟irtus huanglongbing，HLB）。柑橘黃龍病病原菌隸屬于韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberobacter），分為亞洲種（Can-didatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲種（Candidatus Liberibacter americanus）[3-4]，其傳播方式主要為柑橘木虱傳播、嫁接傳播和運(yùn)輸傳播3種方式。

柑橘黃龍病在田間的癥狀表現(xiàn)復(fù)雜難辨，其典型癥狀為葉片斑駁黃化、紅鼻子果、新梢均勻黃化等。目前，國內(nèi)外對(duì)柑橘黃龍病的檢測(cè)方法除了田間癥狀診斷外，還有嫁接診斷、生化和電鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)等[5]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法因其準(zhǔn)確度和靈敏度高、操作簡便、檢測(cè)快速等被廣泛用于柑橘黃龍病的診斷。常用的PCR檢測(cè)方法包括常規(guī)PCR、巢式PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等3種方法。

本文利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)梅州地區(qū)疑似柑橘黃龍病樣品進(jìn)行檢測(cè)。TaqMan探針使用雜交探針，特異性高且可靠，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增片段小、靈敏度好、穩(wěn)定性高、不易受外界污染、操作簡便等優(yōu)勢(shì)，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR更適用于檢測(cè)柑橘黃龍病疑似樣本。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

植物樣品主要來自梅州各個(gè)縣區(qū)的柑橘種植園，植株葉片出現(xiàn)原因不明的黃化現(xiàn)象。陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 植物總基因組DNA的提取。柑橘植株總基因組的提取方法參照天根生物公司高效植物基因組DNA提取試劑盒，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行簡單修改。稱取0.1 g新鮮柑橘葉脈，用剪刀剪碎后放入2 mL離心管中，加入400 μL緩沖液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/μL），置于組織研磨機(jī)（MP Fast-Prep-24）中高速振蕩研磨25 s，后續(xù)提取程序參照基因組提取試劑盒說明書[6]。

取2 μL 提取的基因組DNA 在超微量分光光度計(jì)（Na-noDrop One）上檢測(cè)樣品濃度及純度，剩余樣品置于-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.2.2? ? 引物。利用柑橘黃龍病病原亞洲種的16S rDNA設(shè)計(jì)合成引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體見表1、2。

1.2.3? ? 常規(guī)PCR。常規(guī)PCR的擴(kuò)增體系為25 μL，其中DNA模板1.0 μL，引物 OI1和OI2c各1.0 μL，2xPCRmaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度60 ℃，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min?？瞻讓?duì)照為ddH2O，陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地健康植株提取的基因組DNA，陽性對(duì)照為帶病植株基因組DNA。PCR擴(kuò)增完成后，取6.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，以5.0 μL DNA Marker（DL 2000，TAKARA）為標(biāo)記進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時(shí)間35 min。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，如在1 167 bp（OI1/OI2c為引物）處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則該樣品為陽性，該植株感染黃龍病。

1.2.4? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為20 μL，其中DNA模板2.5 μL，引物HLB asf和HLB asr各0.5 μL，HLB Probe 0.25 μL，Master Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)程序在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOnePlus）上進(jìn)行，在95 ℃條件下預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60℃ 10 s，60 ℃ 20 s同步多次采集熒光，共40個(gè)循環(huán)?？瞻讓?duì)照為ddH2O，陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株提取的基因組DNA，陽性對(duì)照為帶病植株基因組DNA。檢測(cè)結(jié)果以反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（即 CT值）顯示，CT值≤35表示該樣品為黃龍病陽性，CT值>35為陰性，CT值越低，則表明黃龍病菌含量越高。

1.2.5? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度對(duì)比。取同時(shí)通過1.2.3和1.2.4方法檢測(cè)確定為陽性的樣品，通過超微量分光光度計(jì)對(duì)其基因組DNA濃度進(jìn)行檢測(cè)，確定樣品基因組DNA的濃度，并進(jìn)行梯度稀釋，分別用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)稀釋后的系列樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 柑橘總DNA的提取及含量檢測(cè)

以疑似感染黃龍病植株葉片的葉脈為材料提取基因組DNA，基因組DNA的A260/A280比值在1.6～1.9之間，提取效果較好，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2? ? 柑橘黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)常規(guī)PCR方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果的符合程度，用以上2種方法分別對(duì)梅州市各縣區(qū)采集的疑似黃龍病樣品共40個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖1、2及表3。

給常規(guī)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，9個(gè)樣品在1 167 bp處擴(kuò)增出特異性電泳條帶，陰性對(duì)照、空白對(duì)照在此位置無特異性擴(kuò)增條帶;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，12個(gè)樣品的CT值≤35，即為黃龍病陽性，陰性對(duì)照、空白對(duì)照無CT值。對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，只要實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)為陽性的樣品，常規(guī)PCR全為陽性，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)柑橘黃龍病菌結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠且無污染，同時(shí)避免了使用有害物質(zhì)。

2.3? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度對(duì)比

取同時(shí)通過常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)確定為陽性的樣品，通過超微量分光光度計(jì)確定樣品基因組 DNA濃度，并進(jìn)行梯度稀釋，結(jié)果見表4。分別用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)稀釋后的系列樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，在相同稀釋倍數(shù)下，常規(guī)PCR檢測(cè)為陰性的樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度較常規(guī)PCR更高，能夠檢出樣品中痕量的病原菌。

3? ? 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)室在梅州地區(qū)建立了柑橘黃龍病PCR快速檢測(cè)技術(shù)[6]，在檢測(cè)篩查過程中發(fā)現(xiàn)，同樣的植株，半年前檢測(cè)結(jié)果為陰性，在半年后的檢測(cè)中呈陽性，顯示常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)黃龍病感染初期的檢出率較低。因此，本研究建立了以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行柑橘黃龍病疑似植株的檢測(cè)，可以為梅州地區(qū)提供更準(zhǔn)確、更靈敏、更快速的柑橘黃龍病檢測(cè)技術(shù)。

由于柑橘品種種類繁多，在田間情況下感染黃龍病的表現(xiàn)形式不一而同，不同病害、藥害、缺素等表現(xiàn)癥狀也給田間診斷黃龍病增加了難度，且黃龍病菌在植株體內(nèi)含量分布不均勻，因而常導(dǎo)致誤診。而PCR技術(shù)的快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)使其成為當(dāng)前檢測(cè)柑橘黃龍病的主要手段。常規(guī)PCR成本較低，多適用于大規(guī)模的田間初次普查檢測(cè);實(shí)時(shí)熒光定量PCR適合對(duì)常規(guī)PCR沒有檢出的疑似樣品進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)確認(rèn)，或?qū)S龍病菌侵染早期、含菌量較低的樣本，如種苗、接穗等進(jìn)行檢測(cè)。

在實(shí)際應(yīng)用中，可結(jié)合田間診斷，通過“紅鼻子果”以及葉片斑駁黃化這2個(gè)特征對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[8]，并通過常規(guī)PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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