卵泡液中細(xì)胞外囊泡及其攜帶的microRNA對卵泡發(fā)育的作用

王亨琴，王曉梅，孟凱，公緒同，王瑩，張涌，權(quán)富生

·綜 述·

卵泡液中細(xì)胞外囊泡及其攜帶的microRNA對卵泡發(fā)育的作用

王亨琴，王曉梅，孟凱，公緒同，王瑩，張涌，權(quán)富生

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs) 是指細(xì)胞分泌的雙層膜轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡。EVs能從細(xì)胞中攝取大分子物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。在這些大分子物質(zhì)中，研究最多的就是microRNA (miRNA)。miRNA是一種參與基因表達(dá)調(diào)控的非編碼RNA，已證實(shí)在哺乳動物卵泡液EVs中有不同的非編碼RNA存在，EVs攜帶miRNA可以作為自分泌和旁分泌的替代機(jī)制，影響卵泡發(fā)育。文中系統(tǒng)介紹了EVs的種類、特征和分離鑒定方法，重點(diǎn)綜述了EVs及攜帶的miRNA對卵泡發(fā)育的作用，包括早期卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、卵泡優(yōu)勢化以及對顆粒細(xì)胞功能的影響。同時對卵泡液中EVs及其攜帶的miRNA的未來研究進(jìn)行了展望，為卵泡液中EVs及攜帶的miRNA功能的研究及應(yīng)用提供了思路和方向。

卵泡液，細(xì)胞外囊泡，microRNA，卵泡發(fā)育

細(xì)胞外囊泡(EVs) 是指細(xì)胞內(nèi)攜帶的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)功能的雙層膜囊泡。EVs的釋放和攝取是細(xì)胞間通訊的新機(jī)制，其分離純化及內(nèi)容物(主要組成物質(zhì)) 功能的研究已成為現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域研究的一個熱點(diǎn)。

卵巢是雌性哺乳動物的生殖器官，其一個重要功能是產(chǎn)生卵泡和維持卵泡發(fā)育，卵泡發(fā)育到足夠大小排出成熟卵子，進(jìn)行后代繁殖。卵泡發(fā)生的過程涉及體細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間廣泛的細(xì)胞間通訊，卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞在整個卵泡生長和成熟過程中分泌多種因子，這些因子對卵泡發(fā)育至關(guān)重要。卵泡液中存在EVs，并對卵巢功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。EVs中含有一些重要的miRNA，它可以在卵母細(xì)胞和周圍的體細(xì)胞之間穿梭。目前對EVs中的miRNA在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟中的具體作用機(jī)制還知之甚少，但最近的研究清楚地表明，EVs及其內(nèi)miRNA可以影響卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。文中對卵泡液中EVs和miRNAs進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)介紹了其調(diào)控卵泡發(fā)育及相關(guān)生物學(xué)功能的最新發(fā)現(xiàn)，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究的同行提供參考。

1 細(xì)胞外囊泡概述

1.1 細(xì)胞外囊泡的種類和特征

EVs是由原核生物和真核生物釋放的膜結(jié)構(gòu)囊泡[1-3]，包含多種生物活性分子——蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA[4-5]。EVs已被證明含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(特別是高水平的鞘磷脂)、DNA和各種RNA，包括mRNA和非編碼RNA (miRNA、circRNA和lncRNA等)[6]。EVs膜上存在多種蛋白質(zhì)，包括四跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、熱休克蛋白(Hsp70) 和糖磷脂酰肌醇錨定蛋白等[7-10]。研究者已經(jīng)分別從精液、附睪、輸卵管、子宮液和卵泡液中分離出了EVs[11-14]。EVs在大小、分子含量、生物遺傳起源、性質(zhì)和生物活性方面均具有高度異質(zhì)性。

EVs是細(xì)胞外生物流體中發(fā)現(xiàn)的所有類型的囊泡的統(tǒng)稱[15]。EVs的種類主要包括微泡(Microvesicle)、外泌體(Exosome，EXO) 和凋亡小體。微泡也被稱為脫落囊泡，是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡。微囊泡生物發(fā)生涉及大分子運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜、膜脂質(zhì)的重新分布，以及表面的機(jī)械收縮以允許囊泡釋放。由于微泡是通過從質(zhì)膜出芽形成的，分子直徑可達(dá)100– 1 000 nm[16-18]。外泌體與微泡相似，也是膜包圍的小泡，但外泌體儲存在多泡體(Multivesicular body，MVB) 中，當(dāng)MVB與質(zhì)膜融合時，這些外泌體又釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[19](圖1)。外泌體直徑為50–150 nm，尺寸分布較均勻，在電子顯微鏡下呈現(xiàn)出均一的、茶托狀結(jié)構(gòu)[16](圖2)。凋亡小體是細(xì)胞凋亡后期釋放至胞外微環(huán)境的微粒，富含死細(xì)胞碎片特有的凝聚DNA。凋亡小體尺寸分布不均勻，直徑為800–5 000 nm[6,20-22]。由于微泡、外泌體和凋亡小體存在尺寸范圍的重疊，提取到的囊泡通常尺寸不均勻且難以區(qū)分其不同亞型，因此將所分離得到的囊泡統(tǒng)稱為EVs。

EVs對受體細(xì)胞的作用方式包括表面上的分子通過粘附到受體細(xì)胞表面的脂質(zhì)和配體上，使整個囊泡內(nèi)化到受體細(xì)胞中，或EVs的膜與受體質(zhì)膜融合，從而將內(nèi)容物釋放入受體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)與受體細(xì)胞的信息傳遞[6,23]。通過上述方式，EVs中的mRNA和miRNA可以轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞[24]，說明這些囊泡能夠遠(yuǎn)距離運(yùn)輸并與靶細(xì)胞之間進(jìn)行信息交換。

圖1 細(xì)胞外囊泡的釋放

圖2 外泌體的典型特征[25]

1.2 細(xì)胞外囊泡的分離純化與鑒定

1.2.1 細(xì)胞外囊泡的分離純化

EVs存在于不同器官或者組織的體液中，這些生物液體含有多種非囊泡性大分子結(jié)構(gòu)，可能會對EVs的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，EVs分離純化非常重要?，F(xiàn)有的分離純化方法主要包括傳統(tǒng)的高通量方法(如超速離心、密度梯度離心、沉淀法、分子排阻法、場流分級法) 和新方法(如微流控法、非接觸法、免疫吸附法)。

超速離心是分離EVs最常用的傳統(tǒng)方法[26]。先用細(xì)胞碎片在低離心力(300×) 去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，再用高離心力(100 000×) 對EVs進(jìn)行沉淀和濃縮[27]。超速離心法是現(xiàn)在最廣泛使用的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于從大量樣品中純化EVs。密度梯度離心是基于超速離心的、更嚴(yán)格的形式，密度梯度離心根據(jù)EVs的密度(1.15–1.19 g/mL) 將其進(jìn)一步純化[28]。在該方法中，含有不同尺寸的囊泡和大分子的樣品層疊在梯度的表面上，其密度從頂部到底部逐漸增加。在離心過程中，不同的分子以不同的速率沉淀在梯度中，該方法被認(rèn)為產(chǎn)生更高純度的EVs。Li等改良了密度梯度離心法實(shí)現(xiàn)了EVs與非囊泡顆粒分離，回收率更高、純度更高，并且結(jié)構(gòu)和功能保持更好[29]。

除超速離心和密度梯度離心之外，沉淀法(商業(yè)試劑盒) 和尺寸排阻色譜法也較為常用。商業(yè)試劑盒會降低EV的水合作用從而引起沉淀，沉淀的EVs產(chǎn)品可以通過低離心力分離[30]。但這種試劑盒還會產(chǎn)生非均相聚合物顆粒，對于EVs而言缺乏特異性。尺寸排阻色譜法通過凝膠過濾不同大小的分子，從而根據(jù)分子尺寸將EVs和其他分子分離[31]。該分離方法最近已應(yīng)用于囊泡分離，從而從復(fù)雜的生物介質(zhì)中產(chǎn)生純化的EV。具體應(yīng)用時，應(yīng)考慮若干因素，包括介質(zhì)類型、孔徑和EVs與介質(zhì)之間的相互作用等，以提高分離的效率和分辨率。

新的分離純化方法主要有微流體過濾法、非接觸法和免疫親和富集法等。與傳統(tǒng)方法相比，這些新方法所需樣本量較少，且所需時間較短[25]。

1.2.2 細(xì)胞外囊泡的純度鑒定

在EVs的純度鑒定方面，其常用的檢測方法主要包括透射電鏡法、納米粒徑分析法(Nanosight)、Western blotting、流式細(xì)胞術(shù)法等。

其中，透射電子顯微鏡分辨率較高，能夠觀察到EVs典型的結(jié)構(gòu)(均一的、茶托狀結(jié)構(gòu))[28]。此外，掃描電子顯微鏡、低溫電子顯微鏡原子力顯微鏡[28]等均可顯示出典型的EVs的形態(tài)。Nanosight可反映EVs的粒徑分布，用于確定粒子的濃度和粒度分布。光束用于照射樣品中的顆粒，當(dāng)粒子散射光并經(jīng)歷布朗運(yùn)動時，攝像機(jī)記錄 每個粒子的路徑以確定平均速度和擴(kuò)散率，從而得出其濃度和粒徑分布[32]。EVs蛋白評估(如Western blotting) 用于證明樣品中EVs相關(guān)的靶蛋白(如CD63和TSG101等) 的存在[33]。雖然該方法耗時較長，但可以對樣品中靶蛋白定性，從而鑒定EVs純度。流式技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、單顆粒，同時檢測多個參數(shù)[28]，是目前最有潛力應(yīng)用于臨床的外泌體分析技術(shù)。

1.3 細(xì)胞外囊泡內(nèi)容物及其對卵泡發(fā)育的作用

來自供體細(xì)胞的攜帶有生物活性分子的EVs可利用體液到達(dá)靶細(xì)胞并遞送其內(nèi)容物。EVs可以作為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)傳遞的載體，是細(xì)胞間運(yùn)輸和通訊的一種重要機(jī)制。盡管如此，目前對EVs介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的了解仍然有限，許多問題尚未解決。在其他細(xì)胞模型中，已經(jīng)證明EVs能夠轉(zhuǎn)移miRNA、mRNA、線粒體DNA和蛋白質(zhì)[34–36]。

研究表明，EVs可以分泌多種細(xì)胞因子[37]。而細(xì)胞因子是卵巢生理學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，特別是與卵泡發(fā)生和排卵有關(guān)，細(xì)胞因子發(fā)揮多種生物學(xué)功能，從而建造支持卵泡發(fā)育的環(huán)境。某些細(xì)胞因子如TGF-β超家族成員，能夠參與卵泡發(fā)生的所有階段[38]。但是，細(xì)胞因子及其相互作用的研究仍不完整，細(xì)胞因子調(diào)控卵泡發(fā)育的研究還比較匱乏，EVs中細(xì)胞因子對卵泡發(fā)育的作用研究仍存在很大挑戰(zhàn)。

對于miRNA調(diào)控卵泡發(fā)育的研究則較為豐富，miRNA對人類和其他物種卵泡發(fā)育的調(diào)控作用至關(guān)重要。牛動情周期第7天從屬卵泡和優(yōu)勢卵泡的顆粒細(xì)胞miRNA表達(dá)模式顯示顆粒細(xì)胞miRNA的表達(dá)可能與牛動情周期早期卵泡期的卵泡募集、選擇和優(yōu)勢化相關(guān)[39]。對牛大卵泡和小卵泡中顆粒細(xì)胞miRNA的表達(dá)比較，顯示大卵泡中富含的miRNA參與卵泡細(xì)胞增殖、類固醇生成，從而預(yù)防因黃體退化引起的早產(chǎn)[40]。因此，miRNA可隨卵泡發(fā)育階段的不同而表現(xiàn)出差異表達(dá)，從而參與卵泡發(fā)育調(diào)控。

EVs和miRNA代表了一種細(xì)胞間通訊的新機(jī)制，即細(xì)胞可以通過EVs傳遞miRNA。有研究者分別收集了人血漿與卵泡液中的EVs，并統(tǒng)計(jì)了兩者之間差異表達(dá)的miRNA，該研究結(jié)果顯示，人類卵泡液中與血漿相比上調(diào)的37種miRNA在卵泡液中上調(diào)，且其中32個miRNA由外泌體攜帶[41]。da Silveira及其同事在馬卵泡液中對EVs進(jìn)行了鑒定[42]。Sohel等從牛卵泡液中分離出EVs，并證明EVs能夠轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA，且生長卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞的卵泡液EVs miRNA差異表達(dá)[43]。另有研究者證明了EVs存在于牛卵泡液中，且隨著卵泡大小的變化，卵泡液所含的EVs miRNA存在動態(tài)變化，即隨著卵泡直徑的增加，5種miRNA (miR-204、miR-92b、miR-328a-3p、miR-424-3p和miR-450a) 的表達(dá)顯著增加；2種miRNA (miR-19a-3p和miR-335) 表達(dá)顯著減 少[44]。除此之外，牛卵泡液中的外泌體和非外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)均對卵母細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生重要影響，這些影響是通過一系列miRNA起作用的[43]。

2 細(xì)胞外囊泡中的miRNA在卵泡發(fā)育中的作用

細(xì)胞外囊泡中含有miRNA，其中某些miRNA參與卵泡發(fā)育過程[44-45]。文中對已經(jīng)公開發(fā)表的、已證實(shí)存在于EVs的miRNA及其對卵泡發(fā)育的作用進(jìn)行了總結(jié)(表1)，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了概述(表2)。以下將進(jìn)行詳細(xì)探討。

表1 細(xì)胞外囊泡中的miRNA在卵泡發(fā)育中的作用

Table 1 Role of miRNAs in extracellular vesicles in follicular development

表2 細(xì)胞外囊泡中miRNA的作用機(jī)制

2.1 細(xì)胞外囊泡中的miRNA影響原始卵泡的形成和發(fā)育

牛卵泡液EVs中含有多種miRNA，并且miRNA的種類和數(shù)目隨著卵泡直徑的增加有著顯著差異。研究分析大、中、小卵泡(大卵泡直徑>9mm，中卵泡直徑6–9 mm，小卵泡3–5 mm) miRNA含量的不同，發(fā)現(xiàn)在小卵泡中miR-143的表達(dá)量是大卵泡中表達(dá)量的2倍以上[44]。在此之前，研究者探究了miR-143在小鼠卵巢原始卵泡形成期間的表達(dá)和功能。從受精后15.5 d到產(chǎn)后4 d，miR-143表達(dá)在原始卵泡形成期間持續(xù)增加。進(jìn)一步的研究表明，miR-143通過抑制前顆粒細(xì)胞的增殖和下調(diào)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因(、、) 和蛋白激酶基因(、) 的表達(dá)來抑制原始卵泡的形成[46]。

Andade及其同事研究了牛卵泡中miRNA的來源，主要涉及細(xì)胞和EVs這兩種來源，其中，miR-145主要存在于卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物分泌的EVs中，而未在顆粒細(xì)胞分泌的EVs中發(fā)現(xiàn)[47]。有研究者分析了新生小鼠卵巢中miRNA的表達(dá)模式，鑒定了在3日齡和5日齡小鼠的卵巢之間豐度差異顯著的24種miRNA，結(jié)果顯示48個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受上調(diào)的miRNA調(diào)節(jié)，29個途徑受下調(diào)的miRNA調(diào)節(jié)，并建立了TGF-β信號通路相關(guān)基因的miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在參與該途徑的miRNA中，選擇miR-145用于進(jìn)一步分析。使用RNA拮抗劑(AT) 組中原始卵泡的平均卵母細(xì)胞直徑顯著高于AT陰性對照(AN) 組，而AT組中生長卵泡的平均卵母細(xì)胞直徑小于AN組。同時，研究顯示miR-145 AT顯著降低卵泡發(fā)育相關(guān)基因(、和) 的mRNA表達(dá)水平，表明miR-145的下調(diào)降低了卵母細(xì)胞生長的能力。miR-145的增加會導(dǎo)致靶基因的表達(dá)降低和下游Smad信號傳導(dǎo)途徑的抑制，以抑制原始卵泡發(fā)育的起始并維持原始卵泡池的休眠[48]。小鼠上miR-145的下調(diào)使原始卵泡數(shù)量顯著減少和卵泡生長增加，在有腔卵泡的卵泡液EVs中的miR-145是否也有相似的作用，從而調(diào)控原始卵泡的形成和發(fā)育以及有腔卵泡的發(fā)育，目前還不得而知。

2.2 細(xì)胞外囊泡中的miRNA影響卵母細(xì)胞發(fā)育和卵泡優(yōu)勢化

在早期卵泡發(fā)育中，存在于卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物分泌的EVs中的miR-145除了表現(xiàn)出對原始卵泡池的抑制之外，還在牛的優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡中表現(xiàn)出差異表達(dá)，在從屬卵泡中含量更高。miR-145在卵母細(xì)胞的生長期表現(xiàn)出較大的轉(zhuǎn)錄活性，這就暗示其與卵泡發(fā)育和優(yōu)勢化有關(guān)[43]。而在分子水平上，使用miR-145 RNA拮抗劑(AT) 組顯著降低了小鼠卵泡發(fā)育相關(guān)基因(、和) 的mRNA表達(dá)水平[48]，表明miR-145的下調(diào)降低了卵母細(xì)胞生長的能力，miR-145與卵泡的發(fā)育和優(yōu)勢化密切相關(guān)。

除了miR-145以外，miR-212、miR-132、miR-224、miR-378和miR-21均在馬優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡中差異表達(dá)，且在從屬卵泡中，miR-145、miR-132和miR-378的水平更高[43,49-50]。其中，miR-132能在牛顆粒細(xì)胞分泌的EVs中檢測到[47]。MiR-132在牛大卵泡(直徑>9 mm) 細(xì)胞外囊泡的含量是小卵泡(直徑3–5 mm) 的17倍[44]。

在牛卵泡液EVs中，miR-378隨著卵泡增大含量降低，小卵泡(直徑3–5 mm) 中的含量是大卵泡(直徑>9 mm) 的2倍以上[44]，且從屬卵泡的含量顯著高于健康生長的優(yōu)勢卵泡[43]。未排卵卵泡的miR-378水平較高，而IGF1水平較低[49]。在卵丘卵母細(xì)胞成熟期間，卵丘細(xì)胞中miR-378的過度表達(dá)削弱了與卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因(、) 和卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因(、、) 的表達(dá)[51]。上述結(jié)果表明，在卵丘細(xì)胞中，miR-378的表達(dá)能夠抑制卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的擴(kuò)張和卵母細(xì)胞成熟。

與miR-378類似，隨著卵泡的增大，牛卵泡液EVs中miR-21的含量也逐漸降低[44]，且同樣地，在牛從屬卵泡與未排卵卵泡中miR-21含量居高，優(yōu)勢卵泡中含量較低[43]。

綜上所述，卵泡液EVs中存在miR-145、miR-21、miR-132和miR-378，與優(yōu)勢卵泡相比這4種miRNA均在馬的從屬卵泡中含量較高。但用排卵劑量的hCG處理優(yōu)勢卵泡得到黃體化卵泡后，miR-132和miR-21含量均大幅上升，更有趣的是，和等基因在黃體化卵泡中含量與優(yōu)勢化卵泡相比則大幅降低[49]。這幾種基因與上述miRNA是否存在靶向關(guān)系從而調(diào)控馬卵泡發(fā)育和優(yōu)勢化還不清楚。

2.3 細(xì)胞外囊泡中的miRNA影響顆粒細(xì)胞功能

2.3.1 細(xì)胞外囊泡中的miRNA影響顆粒細(xì)胞增殖和凋亡

顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡對卵泡發(fā)育至關(guān)重要，EVs及其內(nèi)部的miRNA對顆粒細(xì)胞增殖與凋亡有重要影響。miR-145存在于牛卵泡液EVs中[47]。對小鼠的研究表明，miRNA-145靶向，通過調(diào)節(jié)Tgf-β信號通路，抑制顆粒細(xì)胞增殖[52]。除此之外，miR-145還可保護(hù)小鼠顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。體外實(shí)驗(yàn)證明，H2O2處理KGN細(xì)胞和小鼠顆粒細(xì)胞顯著下調(diào)了miR-145表達(dá)，而miR-145過表達(dá)可以減弱H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡[52]。此外，小鼠上的研究也證明，miR-145通過靶向保護(hù)顆粒細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[53]?？傊琺iR-145在小鼠上通過靶向調(diào)控Tgf-β信號通路，抑制顆粒細(xì)胞增殖，通過靶向保護(hù)顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而防止卵泡閉鎖異常，并可改善卵巢功能。

牛卵泡液細(xì)胞外囊泡中已證明含有miR-21[43]。在小鼠上也證明，miR-21被確定為增殖性顆粒細(xì)胞向終末分化的黃體細(xì)胞轉(zhuǎn)變所需的重要因子，小鼠miR-21的敲除導(dǎo)致排卵率下降，顆粒細(xì)胞中miR-21的缺失促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，而miR-21的表達(dá)增加則對細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作 用[54]。在大鼠中，去甲腎上腺素(NE) 以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)初級顆粒細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，miR-21參與NE介導(dǎo)的大鼠顆粒細(xì)胞凋亡，并通過靶向阻斷顆粒細(xì)胞凋亡[55]。上述研究均證明了miR-21在小鼠和大鼠顆粒細(xì)胞中有抗細(xì)胞凋亡作用。

牛卵泡液細(xì)胞外囊泡中也證明同時表達(dá)miR-26b[43]。透明質(zhì)酸合成酶2 (HAS2)-透明質(zhì)酸(HA)-CD44-Caspase-3途徑參與哺乳動物的顆粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，miR-26b靶向基因調(diào)控HAS2-HA-CD44-Caspase-3信號通路進(jìn)而促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞凋亡[56]。同樣地，miR-26b調(diào)節(jié)豬顆粒細(xì)胞凋亡還有其他途徑。Smad4是轉(zhuǎn)化生長因子β1 (Tgf-β1) 信號通路的中樞介質(zhì)，與哺乳動物的生殖能力和卵巢卵泡的發(fā)育密切相關(guān)，的敲低增加了GCs的凋亡[57]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-26b靶向基因的3′非翻譯區(qū)，抑制了mRNA和蛋白質(zhì)水平，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[58]。以上研究表明了miR-26b可通過調(diào)控Tgf-β信號傳導(dǎo)途徑中Smad4的表達(dá)而在顆粒細(xì)胞中具有促凋亡作用。另外研究者針對健康卵泡，早期閉鎖和已經(jīng)閉鎖的豬卵泡構(gòu)建miRNA表達(dá)譜，并選擇和分析差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)在豬卵泡閉鎖期間上調(diào)的miR-26b通過靶向(Ataxia telangiectasia-mutated gene) 增加了DNA斷裂的數(shù)量并促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡[59]。但是這些miRNA是否來源于豬卵泡液EVs，還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

2.3.2 細(xì)胞外囊泡中的miRNA影響顆粒細(xì)胞類固醇生成

顆粒細(xì)胞類固醇生成對卵泡發(fā)育至關(guān)重要。有研究表明，miR-378在小卵泡EVs中的含量是大卵泡的2.4倍，且隨著卵泡增大而逐漸減少[44]。體外過表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)表明，豬miR-378通過靶向的3′ UTR內(nèi)的特定位點(diǎn)，降低豬顆粒細(xì)胞中Cyp19a1蛋白表達(dá)和雌二醇產(chǎn)生，卵丘細(xì)胞中的Cyp19a1表達(dá)也被miR-378抑制，導(dǎo)致雌二醇產(chǎn)生顯著降低[60]。3′ UTR中的2個結(jié)合位點(diǎn)被鑒定并確認(rèn)為豬miR-378的結(jié)合位點(diǎn)[51,60]。

MiR-132存在于牛顆粒細(xì)胞分泌的EVs 中[43-44]，可以對顆粒細(xì)胞類固醇生成產(chǎn)生重要影響。Nurr1是一種抑制Cyp19a1表達(dá)的孤核受 體[61]。對小鼠的研究證明，是miR-132的直接靶標(biāo)，miR-132通過抑制，顯著促進(jìn)Cyp19a1的表達(dá)和雌二醇的分泌[62]。

3 EVs未來研究展望

EVs及其攜帶的miRNA已證明在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，其調(diào)控關(guān)系較為復(fù)雜。但是，對于卵泡液中EVs及攜帶的miRNA的功能研究還較為匱乏?，F(xiàn)根據(jù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和本實(shí)驗(yàn)室開展的工作，對卵泡液EVs及攜帶的miRNA的相關(guān)研究提出以下研究內(nèi)容和研究方向：(1) 卵泡液中的EVs如何有選擇性地隨著卵泡發(fā)育攝取有利于卵泡發(fā)育的miRNA和其他內(nèi)含物，影響卵母細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程和質(zhì)量。(2) 不同物種卵泡液EVs特異性miRNA的篩選和鑒定以及作用途徑的研究。(3) 卵泡液中EVs特異性miRNA在卵泡發(fā)育、卵泡優(yōu)勢化以及卵母細(xì)胞成熟過程中是否是通過進(jìn)入卵泡不同受體細(xì)胞發(fā)揮多種生物學(xué)功能？(4) 卵泡液EVs及攜帶的miRNA的作用調(diào)控機(jī)制以及涉及的相關(guān)信號通路的研究。(5) 卵泡液EVs其他內(nèi)容物對卵泡發(fā)育的作用研究。卵泡液EVs是否可以通過攜帶的其他內(nèi)容物，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、lncRNA、circRNA等影響卵泡發(fā)育以及卵母細(xì)胞成熟等功能。(6) 卵泡液EVs其他內(nèi)容物與卵泡液中EVs miRNA的互作研究。卵泡液中存在EVs還有特異性的蛋白質(zhì)和其他成分，這些成分與miRNA如何互作、如何協(xié)同發(fā)揮作用也是未來需要研究的內(nèi)容和關(guān)注的重點(diǎn)。(7) 動物體激素、抗原、細(xì)胞因子以及其他外源性的物質(zhì)是否對卵泡液EVs的成分和功能產(chǎn)生影響？如何發(fā)揮作用和調(diào)控？

由于miRNA與靶基因間相互作用的復(fù)雜性以及不同物種間miRNA作用途徑的差異性，卵泡液EVs及攜帶miRNA的功能研究任重而道遠(yuǎn)。但充分認(rèn)識卵泡液EVs及攜帶的內(nèi)容物對卵泡發(fā)育的作用、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、充分利用家畜卵巢資源以及提高人類輔助生殖水平將有重要意義。

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Effect of extracellular vesicles and microRNAs in follicular fluid on follicular development

Hengqin Wang, Xiaomei Wang, Kai Meng, Xutong Gong, Ying Wang, Yong Zhang, and Fusheng Quan

Key Laboratory of Animal Biotechnology, Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Extracellular vesicles (EVs) refer to bilayer membrane transport vesicles secreted by cells. EVs can take macromolecules from cells and transfer them to receptor cells. Among these macromolecular substances, the most studied are microRNAs (miRNAs). miRNA is non-coding RNA involved in the regulation of gene expression. It has been confirmed that there are different non-coding RNAs in mammalian follicular fluid EVs. EVs carrying miRNA can act as an alternative mechanism for autocrine and paracrine, affecting follicular development. This paper systematically introduced the kinds, characteristics and methods of isolation and identification of EVs, focusing on the effects of EVs and miRNAs on follicular development, including early follicular development, oocyte maturation, follicular dominance and effects on granulosa cell function. At the same time, the authors prospected the future research of EVs and microRNAs in follicular fluid, and provided ideas and directions for the research and application of EVs and miRNA functions in follicular fluid.

follicular fluid, extracellular vesicle, microRNA, follicular development

June12, 2019;

July25, 2019

Supported by: National Major Project (Nos. 2016ZX08007002, 2016ZX08007003).

Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: zhangyong1956@nwsuaf.edu.cn

Fusheng Quan. Tel: +86-29-87080092; E-mail: quanfusheng@nwsuaf.edu.cn

10.13345/j.cjb.190250

國家科技重大專項(xiàng) (Nos. 2016ZX08007002, 2016ZX08007003) 資助。

2019-08-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190805.1059.003.html

王亨琴, 王曉梅, 孟凱, 等.卵泡液中細(xì)胞外囊泡及其攜帶的microRNA對卵泡發(fā)育的作用. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(4): 632–642.

Wang HQ, Wang XM, Meng K, et al. Effect of extracellular vesicles and microRNAs in follicular fluid on follicular development. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 632–642.

(本文責(zé)編 郝麗芳)