于海寬，馮韜錦，王端陽，姜矞恒，陳銘，李毅，尹鵬濱，張里程，唐佩福，劉蜀彬

1 解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 骨科醫(yī)學部，北京 100853；3 國家骨科與運動康復臨床醫(yī)學研究中心 骨科，北京 100853；4 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心 骨科，北京 100071；5 解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 骨科，廣東廣州 510010；6 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 骨科，黑龍江哈爾濱 150086

細菌、古細菌、真核生物都會向外部環(huán)境釋放出納米尺寸的外膜囊泡[1-2]。細菌外囊泡中含有特定的內(nèi)容物，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)及從細菌母體釋放出的各種代謝產(chǎn)物[3]。細菌外囊泡在細菌生長過程中不斷被釋放，可參與細菌生長、生物膜形成、水平基因轉(zhuǎn)移、應激反應、營養(yǎng)獲取、毒素傳遞、抗生素耐藥、宿主免疫調(diào)節(jié)等相關生物學過程[3-11]。近年來研究人員將細菌外囊泡作為天然免疫原性、可修飾的新型遞送載體，廣泛應用于構(gòu)建新型疫苗、靶向遞送藥物等領域[5-7,12]。細菌外囊泡具有廣闊的臨床應用前景，然而目前對于細菌外囊泡的特性研究仍處于初始階段。革蘭陰性(G-)細菌和革蘭陽性(G+)細菌具有不同的細胞壁結(jié)構(gòu)，其細菌外囊泡產(chǎn)生的機制也截然不同。在革蘭陰性菌中，細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)疏松，分為內(nèi)膜、周質(zhì)空間和細胞壁外膜，細菌囊泡從外膜被夾斷，因此被稱為外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)；其內(nèi)容物包括細胞質(zhì)、周質(zhì)和細胞壁成分，直徑為20～ 250 nm[13-14]。革蘭陽性細菌的細胞壁厚度為20～ 80 nm，沒有細胞壁外膜，細胞壁呈現(xiàn)高度交聯(lián)的狀態(tài)，革蘭陽性細菌囊泡來源于細胞質(zhì)，稱為細胞質(zhì)囊泡(cytoplasmic membrane vesicle，CMV)，其內(nèi)容物包括細胞質(zhì)和細胞膜成分，直徑為20～ 400 nm[15]。兩種類型細菌外囊泡的特性目前研究較少。本研究擬以大腸埃希菌和金葡菌為代表，探索革蘭陰性菌和革蘭陽性菌細菌外囊泡的理化性質(zhì)和生物學特性，初步分析不同來源細菌外囊泡潛在臨床應用場景，為細菌外囊泡進一步臨床應用和工程化制備奠定基礎[16]。

材料與方法

1 菌株、試劑和儀器 金葡菌(BNCC186335)和大腸埃希菌(BL21) 購買自豐海生物。RAW264.7細胞系購買自北京協(xié)和醫(yī)院細胞資源中心。NB 肉湯培養(yǎng)基(AOBOX 公司)；胎牛血清(Gibco 公司)；DMEM 培養(yǎng)液、α-MEM 培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗液、胎牛血清(Corning 公司)；BCA 試劑盒(上海碧云天生物有限公司)；Zombie NIR?死活染色液、Alexa Fluor? 488 anti-mouse F4/80 Antibody、PE anti-mouse/human CD11b Antibody、APC antimouse CD86 Antibody、Alexa Fluor? 700 antimouse CD206 (MMR) Antibody (Biolegend公司)；NTA(Particle Metrix 公司)；電鏡(日本JOEL 公司)；Dynamic Light Scattering (NANO ZS 公司)；流式細胞儀(Beckman 公司)；酶標儀(Tecan infinite m200 pro 公司)。

2 細菌培養(yǎng)和外囊泡的提取 以36 g NB 粉與1 L 水的比例配制肉湯培養(yǎng)基，用玻璃棒攪拌均勻，用封口膜密封，高溫液體滅菌后，將1 mL 菌液放入2 L 細菌培養(yǎng)基。放入恒溫搖床中，至培養(yǎng)基OD600達到1.0(約8 h 后)，收集細菌培養(yǎng)基。將細菌培養(yǎng)8 h后，先用離心機8 000 g 離心20 min去除游離的細菌，再用0.45 μm 水系濾膜過濾泵對培養(yǎng)基進行過濾，進一步去除游離的細菌。將去除菌體的細菌上清液放入5 L 的燒瓶中。連接切向流過濾系統(tǒng)對細菌菌液進行濃縮，濃縮至60 mL后，停止?jié)饪s。將其放入超速離心管中，100 000 g離心3 h后，棄上清，PBS 重懸后離心100 000 g再次離心70 min，用1 mL PBS 重懸即為最終提取的細菌外囊泡，凍存于-80℃中備用。

3 細菌外囊泡電鏡鑒定 將20 μL 提取的金葡菌和大腸埃希菌的BEVs 懸液加載至200 目銅網(wǎng)表面，室溫靜置5 min，用濾紙吸干液體后加入醋酸雙氧鈾復染2 min，用濾紙吸干表面染料。再用蒸餾水洗滌銅網(wǎng)3次，室溫干燥。然后用透射電鏡進行觀察拍攝。

4 細菌外囊泡的顆粒數(shù)檢測 使用Zeta View 粒徑分析儀檢測，將樣品與PBS 按照1∶5 000 的比例進行稀釋至5 mL。首先用標準品對儀器進行校準。然后將5 mL 樣品注入，選擇預設的程序?qū)悠返念w粒數(shù)進行檢測。最后用無菌雙蒸水將儀器進行清洗。

5 細菌外囊泡的粒徑與Zeta 電位檢測 使用動態(tài)光散射粒度儀 (dynamic light scattering，DLS)檢測，將樣品與PBS 按照1∶100 的比例混合形成1.5 mL 的稀釋液，加入特定的樣品池中，將樣品池放入DLS 儀器中。選擇預設的程序，通過納米顆粒示蹤分析儀捕獲并分析納米顆粒物質(zhì)在溶液中的布朗運動情況，對樣品的粒徑和電位大小進行檢測。

6 細菌外囊泡的蛋白定量 向50 μL 的細菌外囊泡樣本中加入50 μL RIPA 裂解液，置于冰上裂解30 min，10 000 g 離心，吸取上清至新的EP 管。根據(jù)BCA 試劑盒的說明書配置工作液和不同梯度的標準品。向96 孔板中每孔加入20 μL 樣品和200 μL 工作液，37℃孵育0.5 h。通過酶標儀在562 nm 處進行吸光值檢測，根據(jù)標準品算出標準曲線，并計算出樣品濃度。

7 RAW264.7 的激活 RAW264.7 是一種巨噬細胞系，是炎癥細胞模型之一，用于細胞吞噬、細胞免疫、分子免疫學研究中。將復蘇后的RAW264.7以5 × 104/孔傳至24 孔板，用DMEM(含有10%FBS 和1% 雙抗) 培養(yǎng)1 d。通過NTA 檢測兩種細菌外囊泡顆粒數(shù)后，按照1 × 108個囊泡/mL配置DMEM 培養(yǎng)基，對RAW264.7 進行干預。加入同等體積的PBS 緩沖液作為對照組。用Zombie NIR?死活染色液、Alexa Fluor? 488 anti-mouse F4/80 Antibody、PE anti-mouse/human CD11b Antibody、APC anti-mouse CD86 Antibody(Biolegend)、Alexa Fluor? 700 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody 對細胞進行染色，通過流式上機檢測其各項指標的表達情況。

8 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism9.0 進行數(shù)據(jù)分析。采用Shapiro-wilk 檢驗評估數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的兩組計量資料采用非配對雙尾t檢驗(unpaired two-tailedt-test) 進行比較，多組計量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 細菌外囊泡透射電鏡分析 利用切向流過濾系統(tǒng)結(jié)合超速離心法(圖1)成功提取金葡菌和大腸埃希菌的細菌外囊泡，透射電鏡下均可觀察到杯狀、茶托狀的雙層膜結(jié)構(gòu)(圖2)，大小為20～ 300 nm，呈分散或聚集分布。其中金葡菌的細菌外囊泡直徑相比大腸埃希菌分泌的細菌外囊泡略大，視野中囊泡的數(shù)量相比大腸埃希菌的細菌外囊少。

圖1 細菌外囊泡提取示意圖A：切向流過濾系統(tǒng) B：超速離心Fig.1 Schematic representation of BEVs extractionA: Tangential flow filter system B: Ultracentrifugation

圖2 提取的兩種細菌外囊泡形態(tài)的電鏡圖片A：金葡菌來源的細菌外囊泡；B：大腸埃希菌來源的細菌外囊泡Fig.2 Electron microscope photographs of BEVs of two types of bacteria extractedA: BEVs derived from S.aureus;B: BEVs derived from E.coli

2 兩種細菌外囊泡粒徑分布和Zeta 電位比較金葡菌外囊泡直徑50.75 nm，粒徑范圍37.84～396.1 nm；大腸埃希菌外囊泡直徑為22.15 nm，粒徑范圍13.54～ 78.82 nm，比金葡菌直徑略小。此外，金葡菌和大腸埃希菌的細菌外囊泡帶負電荷，分別為(-19.7 ± 0.17) mV 和(-24.1 ± 2.55) mV，提示均為膜結(jié)構(gòu)，大腸埃希菌外囊泡Zeta 電位略低于金葡菌外囊泡(P＜0.05)。見圖3。

圖3 DLS 檢測兩種細菌外囊泡粒徑分布及Zeta 電位(n=3)A：金葡菌來源的細菌外囊泡的粒徑分布；B：大腸埃希菌來源的細菌外囊泡的粒徑分布；C：兩種細菌外囊泡的Zeta 電位Fig.3 The particle size and Zeta potential of BEVs of two types of bacterial measured by DLS (n=3)A: The particle size of BEVs derived from S.aureus;B: The particle size of BEVs derived from E.coli;C: Zeta potential of BEVs of two types of bacteria

3 兩種細菌外囊泡產(chǎn)量和純度比較 圖4 所示金葡菌和大腸埃希菌外囊泡蛋白產(chǎn)量分別為(0.94 ±0.04) mg 和(1.71 ± 0.19) mg；顆粒數(shù)分別為4.00 × 1011(± 1 × 1010)/mL 和9.47 × 1011(± 2.52 × 1010)/mL；說明在同等培養(yǎng)條件下，大腸埃希菌分泌的囊泡顆粒數(shù)更多，蛋白產(chǎn)量更高(P＜0.05)。通過顆粒數(shù)/蛋白量比值可以觀察到單位蛋白量中大腸埃希菌外囊泡數(shù)為5.59 × 1011(± 1.6 × 1010)，而金葡菌外囊泡數(shù)為4.24 × 1011(± 6.43 × 1010)，說明大腸埃希菌外囊泡的純度更高(P＜0.001)。

圖4 金葡菌和大腸埃希菌來源細菌外囊泡顆粒數(shù)、總蛋白量、顆粒數(shù)/蛋白比值(n=3)A：NTA 檢測兩種細菌外囊泡的顆粒數(shù)；B：BCA 法檢測兩種細菌外囊泡的總蛋白量；C：兩種細菌外囊泡的顆粒數(shù)/蛋白總量比值Fig.4 Particle number,total protein amount,particle number/protein ratio of bacterial outer vesicles derived from S.aureus and E.coli (n=3)A: Particles of BEVs of two types of bacterial measured by NTA;B: Total protein content of BEVs of two types of bacterial measured by BCA;C: Particles/total protein ratios of BEVs of two types of bacteria

4 兩種細菌外囊泡對巨噬細胞系RAW264.7 的刺激作用 如圖5 所示，兩種細菌外囊泡與巨噬細胞系RAW264.7 共孵育48 h，加入相同體積的PBS作為對照組，通過流式抗體CD86(M1 型巨噬細胞的標志蛋白) 和CD206(M2 型巨噬細胞的標志蛋白)染色觀察細菌外囊泡對RAW264.7 細胞的激活情況。結(jié)果顯示兩種細菌外囊泡都能激活RAW264.7細胞，促進巨噬細胞系向M1 型轉(zhuǎn)化。加入金葡菌囊泡后，RAW264.7 的CD86 表達陽性細胞占比為20.23%，相比對照組(PBS 組)升高45.9 倍(P＜0.001)；CD206 表達陽性細胞占比為4.5%，相比對照組升高34.6 倍(P＜0.001)。大腸埃希菌外囊泡刺激后RAW264.7 的CD86 表達陽性細胞占比為11.16%，相比對照組(PBS 組)升高25.4 倍(P＜0.001)；CD206 表達陽性的細胞占比為2.09%，相比對照組升高16.1 倍。另外金葡菌囊泡干預組CD86和CD206 表達陽性的細胞占比較大腸埃希菌組更高(P＜0.05)，表明金葡菌外囊泡相比大腸埃希菌外囊泡對RAW264.7 的激活作用更明顯。

圖5 兩種細菌外囊泡對RAW264.7 激活情況流式檢測(n=3)A：PBS 組RAW264.7 的CD86 陽性細胞占比；B：在金葡菌細菌外囊泡刺激后，RAW264.7 的CD86 陽性細胞占比；C：在大腸埃希菌細菌外囊泡刺激后，RAW264.7 的CD86 陽性細胞占比；D：對金葡菌和大腸埃希菌的細菌外囊泡刺激后的CD86 陽性細胞占比統(tǒng)計；E：PBS 組RAW264.7 的CD206 陽性細胞占比；F：在金葡菌細菌外囊泡刺激后，RAW264.7 的CD206 陽性細胞占比；G：在大腸埃希菌細菌外囊泡刺激后，RAW264.7 的CD206 陽性細胞占比；H：對金葡菌和大腸埃希菌的細菌外囊泡刺激后的CD206 陽性細胞占比統(tǒng)計Fig.5 Activation of RAW264.7 in BEVs of two types of bacterial detected by flow cytometer (n=3)A: The proportion of CD86 positive cells in RAW264.7 in PBS group;B: The proportion of CD86 positive cells in RAW264.7 after BEVs from S.aureus stimulation;C: The proportion of CD86 positive cells in RAW264.7 after stimulation of BEVs from E.coli;D: Statistics of the percentage of CD86 positive cells stimulated by BEVs of S.aureus and E.coli;E: The proportion of CD206 positive cells in RAW264.7 in PBS group;F: The proportion of CD206 positive cells in RAW264.7 after BEVs from S.aureus stimulation;G: The proportion of CD206 positive cells in RAW264.7 after stimulation of BEVs from E.coli;H: Statistics of the percentage of CD206 positive cells stimulated by BEVs of S.aureus and E.coli

討論

細菌分泌的細菌外囊泡中含有一系列來自菌體的內(nèi)容物，包括脂多糖、肽聚糖、菌膜、細菌周質(zhì)、毒素蛋白和核酸[3]。細菌外囊泡在疾病的發(fā)生發(fā)展、細菌耐藥性的產(chǎn)生等過程中均具有重要作用，在腫瘤治療、感染、疫苗等領域已開展大量研究。Zhang等[17]通過幽門螺桿菌外囊泡包裹聚乳酸納米顆粒與胃黏膜上皮競爭性結(jié)合以減少幽門螺桿菌在胃黏膜上的定植；Chen等[18]通過將黑色素瘤細胞膜與沙門菌囊泡融合，再聯(lián)合光熱治療來抑制黑色素瘤的發(fā)展；Li等[19]通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使細菌外囊泡表達PD1 抗體治療結(jié)腸癌；Gao等[20]通過金葡菌外囊泡包載抗生素靶向治療胞內(nèi)金葡菌感染。關于細菌外囊泡的特性研究，目前仍處于初始階段。

本研究通過應用切向流過濾系統(tǒng)結(jié)合超速離心法提取的金葡菌和大腸埃希菌外囊泡在電鏡下有典型的茶托狀、杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)。相比于大腸埃希菌外囊泡，金葡菌外囊泡直徑更大。這可能是兩種細菌分泌細菌外囊泡的方式不同導致的，大腸埃希菌外囊泡由細菌細胞壁外膜產(chǎn)生，而金葡菌是由細菌細胞膜產(chǎn)生[14,21]。大腸埃希菌的Zeta 電位比金葡菌外囊泡低，可能是由于大腸埃希菌細菌的膜蛋白含量更高，導致電負性程度高。從產(chǎn)量上看，在同樣的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間下，大腸埃希菌產(chǎn)生的囊泡數(shù)量更多，蛋白量更高，可能是由于大腸埃希菌菌體更大，細胞壁結(jié)構(gòu)疏松，更容易生成外囊泡[22]。金葡菌受高度交聯(lián)的細胞壁阻礙，產(chǎn)生的細菌外囊泡較少。由于大腸埃希菌外囊泡直徑更小，顆粒數(shù)比金葡菌外囊泡更多，造成大腸埃希菌外膜囊泡的顆粒數(shù)/蛋白比值更高。從生物學效應上看，金葡菌外囊泡相比大腸埃希菌外囊泡對RAW264.7 的激活作用更明顯，可能是由于金葡菌囊泡中攜帶了更多的毒力蛋白等細菌外毒素[15]，促使更多的RAW264.7細胞向M1 型巨噬細胞轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)金葡菌外囊泡直徑大于大腸埃希菌外囊泡，在顆粒數(shù)和蛋白產(chǎn)量方面稍低，但對免疫細胞的激活能力更強。大腸埃希菌激活免疫細胞能力稍差，但囊泡的顆粒數(shù)產(chǎn)量和純度更高[23]。金葡菌外囊泡和大腸埃希菌外囊泡是藥物遞送的良好載體，如果通過工程化改造提高其免疫原性降低毒性，將在腫瘤、疫苗等領域具有很好的應用前景[6,24]。其次，細菌外囊泡在細菌生理和發(fā)病機制中起著至關重要的作用。體液中特異性細菌外囊泡的存在可能與特定的疾病感染狀態(tài)有關，因此細菌外囊泡可能作為臨床診斷的標志物之一[25-26]。另一方面，細菌外囊泡可能提供一種新的抗菌治療策略。雖然這一想法已被提出多年，但迄今為止尚無研究表明這一策略的可行性。細菌外囊泡組成的復雜性和產(chǎn)生的機制尚未明確可能是這種方法的主要難題。目前細菌外囊泡的相關標志性蛋白國際上仍無共識，因此本研究未對細菌囊泡中特異性標志蛋白進行表征。本研究探索比較了金葡菌與大腸埃希菌來源的細菌外囊泡的生物學特性，以期為藥物遞送、疫苗制備提供理論依據(jù)和參考[7,27]。