細(xì)胞外囊泡在肺炎中作用機(jī)制及其診療研究

顧德芳，南 勇

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院<籌>急診危重病科，上海 201600）

感染性肺炎（infectious pneumonia）是由各種原因感染導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)，部分患者可能因病情的加重、不及時(shí)就診、營養(yǎng)不良、治療中癥狀控制不佳、機(jī)體抵抗力下降等原因進(jìn)一步發(fā)展為重癥肺炎[1]。重癥肺炎（severe pneumonia）具有治療難度高、病死率高的特點(diǎn)，給患者及社會(huì)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2]。因此，早期診斷肺炎、早期制定合理的治療方案、及時(shí)評價(jià)重癥肺炎患者的預(yù)后，對于延緩肺炎的發(fā)展、降低相應(yīng)病死率具有重要臨床意義。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles）是由于各種生理、病理和/或外部刺激后，從細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)釋放出來的一組異質(zhì)性囊泡，是細(xì)胞間通信的重要介質(zhì)和細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)器，其內(nèi)含有多種類型的RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器，通過多種途徑調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的多種生物過程[3]。研究表明，細(xì)胞外囊泡具有作為某些疾病診斷和疾病預(yù)后的新型生物標(biāo)志物的潛力[4]，而血漿細(xì)胞外囊泡和炎癥發(fā)展有密切關(guān)系，特別是炎癥與血液中細(xì)胞外囊泡水平的升高相關(guān)[5]。因此，細(xì)胞外囊泡在炎癥的診斷、預(yù)后和治療有望成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本文現(xiàn)對細(xì)胞外囊泡的分類與作用、分離提取與鑒定、與重癥肺炎的相互關(guān)系進(jìn)行綜述，旨在為重癥肺炎敏感診斷方法及有效治療措施提供參考。

1 細(xì)胞外囊泡的分類與作用

細(xì)胞外囊泡是由磷脂雙分子層組成的球形無核微粒，其內(nèi)包含多種mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、受體、DNA 和生物因子等[6]。根據(jù)細(xì)胞外囊泡的顆粒大小將其分為三類：外泌體（Exo）、微囊泡（MV）和凋亡小體（AB）。①外泌體（30～100 nm）是粒徑大小最小的亞群，富含mRNA、miRNA、DNA 和蛋白質(zhì)[7]；②微囊泡（100～1000 nm）被稱為脫落的囊泡、外小體、微?；蚣{米顆粒，是第2 大的囊泡，其表達(dá)豐富的膽固醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和細(xì)胞表面特異性分子[8]；③凋亡小體（100～5000 nm）的粒徑最大，是在細(xì)胞凋亡過程中由質(zhì)膜起泡形成的，包含片段DNA、非編碼RNA、組蛋白和細(xì)胞器等[9]。體細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡后通過與靶細(xì)胞相互作用后將其特定內(nèi)容物作用到靶細(xì)胞，對靶細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的生物調(diào)節(jié)。多種細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡通常存在于血液、腦脊液、尿液、滑液、胸腔積液、精液、唾液和母乳等[10]。細(xì)胞外囊泡通過表面受體-配體相互作用、直接膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞等不同方式作用于靶細(xì)胞，這些作用可直接刺激靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)移囊泡內(nèi)各種信息分子。

2 細(xì)胞外囊泡的分離提取與鑒定

細(xì)胞外囊泡的分離提取方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、過濾和色譜法[11]。目前提取細(xì)胞外囊泡的首選方法是連續(xù)超速離心法，該方法方便、廉價(jià)，并且能夠處理大量樣品。細(xì)胞外囊泡的鑒定方式為：流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法、電子顯微鏡及納米顆粒跟蹤分析（NTA）等方法[12]。細(xì)胞外囊泡的鑒定最常用的方法是流式細(xì)胞術(shù)，其可檢測囊泡的顆粒大小、濃度等指標(biāo)。然而，熒光流式細(xì)胞術(shù)可根據(jù)細(xì)胞外囊泡表面抗原鑒別細(xì)胞外囊泡的細(xì)胞來源。電子顯微鏡主要用于評估細(xì)胞外囊泡的粒徑大小、形態(tài)和表面特異性標(biāo)記物。

3 細(xì)胞外囊泡在肺炎中的機(jī)制

3.1 促炎作用 研究表明[13]，初始的內(nèi)皮損傷可誘導(dǎo)肺泡內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡，暴露于感染性刺激后進(jìn)而啟動(dòng)肺部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。肺泡上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡的濃度可隨著炎癥損傷增強(qiáng)而增加，細(xì)胞外囊泡通過巨噬細(xì)胞的活化來誘導(dǎo)或加重肺炎進(jìn)一步的發(fā)生發(fā)展[14]。另有研究表明[15]，氣管內(nèi)脂多糖可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡進(jìn)入損傷的肺泡，隨后觸發(fā)肺泡上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放相應(yīng)的細(xì)胞外囊泡。在急性呼吸窘迫綜合征模型中，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可以增加肺部中性粒細(xì)胞的募集，從而導(dǎo)致肺損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)一步加重[16]。細(xì)胞外囊泡內(nèi)部特殊信息分子起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌感染的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中，巨噬細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡的miRNA-223 和miRNA-142 表達(dá)上調(diào)，并與抑制巨噬細(xì)胞激活相關(guān)[17]。Pe?aloza HF 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)菌均能促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞外囊泡中IL-36γ 的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致甚至加重肺損傷。Zhang S 等[19]研究結(jié)果提示，內(nèi)皮細(xì)胞來源性細(xì)胞外囊泡還可以誘導(dǎo)肺泡中性粒細(xì)胞募集，增加TNF-α、IL-1β 和過氧化物酶等炎癥因子的產(chǎn)生。研究顯示，隨著社區(qū)獲得性肺炎的嚴(yán)重程度的增加，在患者血漿內(nèi)的細(xì)胞外囊泡表達(dá)的細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHCⅠ）和MHCⅡ逐漸下調(diào)[20]，細(xì)胞外囊泡可能是通過誘導(dǎo)免疫激活的降低進(jìn)而導(dǎo)致肺炎的進(jìn)一步發(fā)展[21]。

3.2 抗炎作用 在肺炎病程中，部分炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡具有明顯抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞或中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡可能對肺損傷具有保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[22]，利用攜帶α2-巨球蛋白的白細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡治療，結(jié)果提示其可減弱內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬作用。Neudecker V 等[23]研究顯示，中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可能對巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞有抗炎作用。Kolonics F 等[24]研究顯示，靜息的中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡對其他中性粒細(xì)胞具有抗炎作用。中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡含有miR-223，可能對巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞有抗炎作用[25]。

3.3 抗病毒作用 在病毒性肺炎中，細(xì)胞外囊泡與病毒的相互作用影響肺炎的疾病病程。研究表明[26]，在流感病毒感染過程中，肺部上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡主要起到滅活病毒顆粒的保護(hù)作用，這些細(xì)胞外囊泡攜帶流感受體α2,3 和α2,6 連接的唾液酸，通過捕獲病毒來發(fā)揮其抗病毒作用。此外，細(xì)胞外囊泡可以通過調(diào)節(jié)其目的細(xì)胞中抗病毒基因的表達(dá)來影響病毒的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)[27]，在肺泡上皮細(xì)胞中過表miRNA-17-5p 可以通過下調(diào)抗病毒蛋白Mx1 來增強(qiáng)流感病毒的復(fù)制。流感病毒感染的小鼠肺泡上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡攜帶細(xì)胞因子IL-36a，進(jìn)而并促進(jìn)小鼠肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子加重炎癥發(fā)展[28]。

4 細(xì)胞外囊泡在肺炎診療中的應(yīng)用

4.1 診斷 目前，多種細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡在肺炎中的診斷應(yīng)用得到不斷開發(fā)，并逐步應(yīng)用于臨床。由于大部分的實(shí)體組織細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡最終會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)，因此很容易通過靜脈穿刺獲取相關(guān)樣本。Pe?aloza HF 等[18]在不同時(shí)間點(diǎn)分析了53 例嚴(yán)重的社區(qū)獲得性肺炎患者血清樣本，4 種miRNAs（miRNA-126，27a，146a 和155）可以區(qū)分患者后期是否發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。Carpi S 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，血漿細(xì)胞外囊泡上表面蛋白的特征可以區(qū)分慢性獲得性肺炎患者曾經(jīng)是否患有急性加重或社區(qū)獲得性肺炎病史。細(xì)胞外囊泡中的1-磷酸鞘氨醇受體3 成為與急性肺損傷等炎癥性疾病嚴(yán)重程度相關(guān)和預(yù)后判定的潛在診斷標(biāo)志物[30]。除血液樣本以外類型的樣本也可能是生物標(biāo)志物的有用來源，吸入性胸腔積液含有細(xì)胞外囊泡，其內(nèi)的miRNA 含量可以提供有關(guān)積液的潛在病因信息，有助于區(qū)分積液源于肺炎、結(jié)核病或肺癌[29]。

4.2 治療 細(xì)胞外囊泡治療肺炎具有明顯效果，已有大量研究結(jié)果為后續(xù)應(yīng)用于臨床治療提供有力依據(jù)。在各種細(xì)菌或病毒誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征（嚴(yán)重的細(xì)菌性脂多糖誘導(dǎo)的肺炎或流感病毒感染）動(dòng)物模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可減輕肺部炎癥和肺水腫的形成，具有較好治療效果[31]。機(jī)體宿主細(xì)胞通過將病毒顆粒與其分泌的細(xì)胞外囊泡暴露的唾液酸結(jié)合來降低流感的傳染性[26]。此外，細(xì)胞外囊泡還提供了藥物靶向遞送的良好性能[32]。Ma Q 等[33]研究了血小板源性細(xì)胞外囊泡作為藥物遞送載體的性能，將血小板來源的細(xì)胞外囊泡裝載TPCA-1（具有抗炎作用的IKK-1 和STAT3 抑制劑）進(jìn)行藥物靶向，轉(zhuǎn)運(yùn)到炎癥部位，具有較好的抑制肺部炎癥細(xì)胞的浸潤的效果。由于重癥肺炎期間機(jī)體向血漿中釋放細(xì)胞外囊泡的特點(diǎn)，通過抑制細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)效應(yīng)以期逆轉(zhuǎn)重癥肺炎的進(jìn)展仍有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞外囊泡在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展病程中發(fā)揮重要作用，由于其負(fù)載多種生物信息分子的載體特性及其通過抽血可采集的便利特點(diǎn)，使其成為了理想的生物標(biāo)志物。細(xì)胞外囊泡作為生物標(biāo)志物在診斷重癥肺炎和識別肺炎病因等方面具有重要作用。目前，針對細(xì)胞外囊泡或其內(nèi)在特定miRNA 治療肺炎/重癥肺炎的實(shí)驗(yàn)研究已取得一定的成果。未來，細(xì)胞外囊泡在重癥肺炎領(lǐng)域的應(yīng)用值得期待，將細(xì)胞外囊泡設(shè)計(jì)成特殊靶向藥物遞送系統(tǒng)到炎癥肺組織局部發(fā)揮作用，制備成疫苗預(yù)防呼吸道疾病及肺炎可能是未來研究熱點(diǎn)。此外，現(xiàn)有研究報(bào)道的細(xì)胞外囊泡的相關(guān)作用及機(jī)制多來自于動(dòng)物模型或體外細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究，期待相關(guān)臨床研究的開展，以便更好地觀察細(xì)胞外囊泡的臨床應(yīng)用潛能，為重癥肺炎的診治提供方向。