張穎君，高慧敏，李子千，胡夢蕓，孫麗靜，劉 茜，呂亮杰，李 輝

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實驗室，河北 石家莊 050035； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，F(xiàn)HB)是由禾谷鐮刀菌引起的一種危害性很強(qiáng)的小麥真菌病害[1]。禾谷鐮刀菌在侵染小麥期間，特異誘導(dǎo)次生代謝基因簇fg3_54表達(dá)，合成一個非核糖體八肽-鐮孢菌素A(Fusaoctaxin A)，使菌絲可以從小麥組織內(nèi)一個細(xì)胞穿壁入侵到相鄰的細(xì)胞，從而導(dǎo)致小麥感病[2]。由于禾谷鐮刀菌會產(chǎn)生真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，所以小麥赤霉病不僅影響小麥產(chǎn)量還嚴(yán)重影響小麥加工品質(zhì)和食用安全性[3-4]。小麥赤霉病在我國長江中下游麥區(qū)發(fā)生比較嚴(yán)重，如江蘇省年均發(fā)生面積約120萬hm2，超過該省小麥種植面積的50%[5]。而近年來，受氣候變化、小麥-玉米輪作和秸稈還田等因素的影響，赤霉病在黃淮冬麥區(qū)有加重的趨勢[6]。河南省2012年小麥赤霉病發(fā)生面積為339.7萬hm2，2016年發(fā)生面積174.0萬hm2 [7]。在河北省中南部小麥赤霉病也有片狀發(fā)生。因此，提高赤霉病抗性已成為黃淮麥區(qū)特別是黃淮南片的主要育種目標(biāo)之一[6]。黃淮麥區(qū)不具備赤霉病田間表型鑒定的理想環(huán)境，而人工鑒定多采用單花滴注或田間噴霧接種的方法，費(fèi)時費(fèi)力。利用分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)手段進(jìn)行小麥抗赤霉病種質(zhì)篩選是培育抗病品種的有效途徑。

目前,已定位到的小麥抗赤霉病QTL位點超過100個，以位于小麥3BS染色體的Fhb1基因抗性最強(qiáng)[1，8]。Fhb1基因最初發(fā)現(xiàn)于蘇麥3和其衍生品種寧7840[9-10]，表現(xiàn)為抗病原菌擴(kuò)展，可降低赤霉病嚴(yán)重度20%左右[11]。多年來人們一直在尋求開發(fā)可用于Fhb1基因鑒定的分子標(biāo)記。Anderson等[12]將Fhb1基因定位到小麥3BS染色體Xgwm533～Xgwm493區(qū)間，Cuthbert等[13]和Liu等[14]將其精細(xì)定位到標(biāo)記sts3B-189～sts3B-206之間，遺傳距離1.2 cM。Liu等[15]將Fhb1基因縮小到261 kb的區(qū)間，開發(fā)了共顯性標(biāo)記UMN10。Bernardo等[16]分析了Fhb1基因附近的EST(Expressed sequence tags)序列，在標(biāo)記Xgwm533～Xgwm493區(qū)間發(fā)現(xiàn)7個SNP與小麥赤霉病抗性相關(guān)，其中Xsnp3BS-8存在于蘇麥3號及其衍生品種中。Rasheed等[17]根據(jù)Xsnp3BS-8位點開發(fā)了KASP(Kompetitive allele specific PCR)標(biāo)記用于小麥種質(zhì)材料Fhb1基因檢測。Rawat等[18]克隆了PFT(Pore-forming toxin-like)基因，認(rèn)為PFT可能是Fhb1基因，PFT有3種基因型：PFT-Ⅰ(蘇麥3號類型)、PFT-Ⅱ(南大2419類型)和PFT-Ⅲ(基因缺失類型)[6]。這些標(biāo)記在小麥抗赤霉病育種過程中起到了一定的作用，但不能將Fhb1等位基因有效區(qū)分。Su等[19]和朱展望等[6]分析了PFT鄰近的His(Histidine-rich calcium-binding protein)基因序列，發(fā)現(xiàn)在蘇麥3號類型品種中His基因在5′-UTR區(qū)(Untranslated region)和部分ORF區(qū)(Open reading frame)存在序列缺失。His基因有3種等位基因類型，分別為His-Ⅰ(蘇麥3號類型，1 309 bp)、His-Ⅱ(2 061 bp)和His-Ⅲ(2 061 bp)。其中His-Ⅰ起始密碼子附近有752 bp缺失，His-Ⅲ與His-Ⅱ長度相同但存在4個SNP變異。根據(jù)此InDel區(qū)段Su等[19]開發(fā)了共顯性標(biāo)記TaHRC-GSM和KASP標(biāo)記TaHRC-Kasp，朱展望等[6]開發(fā)了共顯性標(biāo)記His-InDel，這些標(biāo)記可以較有效的區(qū)分小麥赤霉病抗/感種質(zhì)。本研究對336份小麥主栽品種和種質(zhì)材料利用KASP標(biāo)記TaHRC-Kasp進(jìn)行檢測，然后利用His基因的共顯性標(biāo)記His-InDel進(jìn)行進(jìn)一步驗證，以期篩選出含有Fhb1基因的種質(zhì)材料，為黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病小麥育種提供寶貴的遺傳信息及親本材料。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究共選擇336份小麥主栽品種和種質(zhì)作為試驗材料，其中黃淮冬麥區(qū)312份(包括河北136份、河南89份、山東72份、陜西15份)。由于江蘇、安徽兩省是小麥赤霉病的重發(fā)區(qū)，所以選擇了24份材料(江蘇17份、安徽7份)一并進(jìn)行Fhb1基因檢測。

1.2 KASP標(biāo)記檢測

根據(jù)Su等[19]開發(fā)的Fhb1基因的KASP標(biāo)記，在抗赤霉病基因型(Fhb1+)引物添加FAM熒光，在感赤霉病基因型(Fhb1-)引物添加HEX熒光。Fhb1+引物序列為5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGGGCTCACGTCGTGCAAATGGT-3′，F(xiàn)hb1-引物序列為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCTGTTTCGCTGGGATG-3′，反向通用引物序列為5′-CTTCCAGTTTCTGCTGCCAT-3′。利用此KASP標(biāo)記對336份小麥材料進(jìn)行檢測，采用384孔PCR板，3 μL反應(yīng)體系(包括DNA模板60～100 ng，2×KASP master mixture 2 μL，引物混合液0.056 μL)，PCR擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，65～57 ℃(每循環(huán)降溫1 ℃)退火1 min，10個循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火1 min，35個循環(huán)。KASP檢測采用LGC公司(http://www.lgcgenomics.com)SNP分型檢測系統(tǒng)完成。

1.3 His-InDel標(biāo)記驗證及His基因序列分析

采用朱展望等[6]開發(fā)的His-InDel標(biāo)記對KASP檢測的部分材料進(jìn)行驗證，His-InDel標(biāo)記正向引物序列為5′-ATGCGTGCGCTGTACTTG-3′，反向引物序列為5′-CGTCACAGAGTCCAGTGAAA-3′。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，DNA模板約100 ng，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR Mix購于康為世紀(jì)有限公司(http：//www.cwbiotech.com/)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(http：//invitrogen.tecenet.com)合成。PCR擴(kuò)增在BioRad公司(http：//www.bio-rad.com)MyCycler PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸7 min，10 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)浸泡染色后在BioRad公司凝膠成像系統(tǒng)下照相，記錄電泳結(jié)果。目標(biāo)條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，http：//www.tiangen.com)進(jìn)行回收，操作步驟參見試劑盒說明書。T-載體采用北京全式金生物技術(shù)有限公司(http：//www.transgen.com.cn)Easy-T3載體，連接體系為T-載體1 μL，回收產(chǎn)物4.0 μL，室溫連接20 min。連接后的載體利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g、胰蛋白凍10 g、NaCl 10 g、瓊脂粉6 g、加蒸餾水至1 L)上，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個LB平板挑取6個陽性克隆進(jìn)行測序，序列測定由深圳華大科技公司(http：//www.bgitechsolutions.cn)完成，序列分析采用軟件DNAMAN(http：//www.lynnon.com)和Vector NTI Advance 10(http：//www.invitrogen.com)進(jìn)行。

1.4 PCA分析

對供試的336份材料采用小麥15K芯片(中玉金標(biāo)記生物技術(shù)股份有限公司，http：//www.cgmb.com.cn)進(jìn)行SNP位點檢測。利用R語言編寫程序?qū)NP數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控(Quality control)，去除數(shù)據(jù)缺失(Missing data)>0.5、雜合率>0.1和最小基因頻率(Minmum allele frequency，MAF)>0.05的數(shù)據(jù)。利用Tassel 5.0 軟件進(jìn)行PCA(Principal component analysis)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fhb1基因KASP標(biāo)記檢測結(jié)果

利用Fhb1基因KASP標(biāo)記對供試的336份小麥材料進(jìn)行檢測，有2個河北材料(石家莊75、紫莖白)與3個來自江蘇的抗赤霉病材料(蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13)攜帶FAM熒光，聚集在y軸附近，表現(xiàn)為抗赤霉病類型(Fhb1+)；有3個材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)表現(xiàn)為雜合基因型(Fhb1+/-)；其余材料攜帶HEX熒光信號，聚集在x軸附近，為感赤霉病類型(Fhb1-)(圖1)。

圖1 Fhb1基因KASP標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.1 Fhb1 genotyping analysis using KASP Marker

2.2 His-InDel標(biāo)記檢測結(jié)果

為了驗證KASP標(biāo)記的準(zhǔn)確性，采用朱展望等[6]開發(fā)的His-InDel標(biāo)記對其進(jìn)行進(jìn)一步檢測。檢測品種包括5個KASP標(biāo)記檢測顯示抗赤霉病類型的材料(石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13)、3個雜合基因型材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)和16個感赤霉病類型材料(鄭麥9023、小偃22等)。從圖2可以看出，His-InDel為共顯性標(biāo)記，可以將材料進(jìn)行明顯區(qū)分。石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13和寧豐518擴(kuò)增得到1 309 bp條帶，表現(xiàn)為His-Ⅰ基因型(抗赤霉病類型)；鄭麥9023、西農(nóng)979、小偃22等17個材料擴(kuò)增得到2 061 bp條帶，為His-Ⅱ(感赤霉病類型)；寧麥16表現(xiàn)為Fhb1雜合類型。KASP標(biāo)記與His-InDel標(biāo)記檢測結(jié)果基本一致，但寧豐518品種KASP檢測為Fhb1-基因型，而His-InDel標(biāo)記檢測為Fhb1+基因型；德宏福6號和泊麥7號2份材料KASP檢測為雜合類型，而His-InDel標(biāo)記檢測為Fhb1-基因型。

2.3 His基因序列分析結(jié)果

對蘇麥3號、石家莊75和紫莖白3個品種的His-InDel標(biāo)記PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行回收、測序，分析其His基因序列。結(jié)果顯示，石家莊75、紫莖白與蘇麥3號的His基因序列一致，為1 309 bp，表現(xiàn)為Fhb1+基因型(圖3)。測序結(jié)果進(jìn)一步驗證了His-InDel標(biāo)記檢測的準(zhǔn)確性。

1.鄭麥9023；2.西農(nóng)979；3.小偃22；4.鄭麥366；5.冀5265；6.冀麥325；7.濟(jì)麥22；8.矮抗58；9.農(nóng)大5363；10.輪選103；11.德宏福6號；12.泊麥7號；13.周麥35；14.豫教黑1號；15.晉麥8號；16.寧麥13；17.寧麥16；18.皖981；19.皖農(nóng)306；20.寧豐518；21.石家莊75；22.紫莖白；23.蘇麥3號；24.寧麥9號；M.Marker Ⅲ。

1.Zhengmai 9023；2.Xinong 979；3.Xiaoyan 22；4.Zhengmai 366；5.Ji 5265；6.Jimai 325；7.Jimai 22；8.Aikang 58；9.Nongda 5363；10.Lunxuan 103；11.Dehongfu 6；12.Bomai 7；13.Zhoumai 35；14.Yujiaohei 1；15.Jinmai 8；16.Ningmai 13；17.Ningmai 16；18.Wan 981；19.Wannong 306；20.Ningfeng 518；21.Shijiazhuang 75；22.Zijingbai；23.Sumai 3；24.Ningmai 9；M.Marker Ⅲ.

圖2 His-InDel標(biāo)記PCR檢測結(jié)果
Fig.2 PCR results of His-InDel Marker

圖3 不同品種His基因序列比對分析Fig.3 Alignment of His gene sequences of different cultivars

2.4 基于全基因組SNP位點分析供試小麥材料的親緣關(guān)系

利用小麥15K芯片對336份材料進(jìn)行檢測，共獲得SNP位點13 947個。通過數(shù)據(jù)質(zhì)控，去除4 168個位點，最終獲得9 779個SNP位點用于供試材料的PCA分析。從PCA結(jié)果(圖4)可以看出，336份小麥材料主要分為3個群，分別為河北(紅色菱形)、河南(綠色三角)和山東(藍(lán)色圓圈)。來自陜西(橙色圓圈)的材料多數(shù)與來自河南的材料聚在一起，來自江蘇(紫色方塊)和安徽(黃色菱形)的材料多數(shù)聚在坐標(biāo)軸中心附近。來自河北的攜帶Fhb1基因的2個材料石家莊75和紫莖白位于坐標(biāo)軸中心附近，這2個材料與來自江蘇的材料親緣關(guān)系較近。

圖4 336份小麥材料PCA分析結(jié)果Fig.4 PCA analysis of 336 wheat samples

3 結(jié)論與討論

小麥赤霉病田間表型鑒定受天氣和接種方法等多種因素影響，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，經(jīng)常需要進(jìn)行多年多地點鑒定才能提高鑒定的準(zhǔn)確性[20]，而黃淮麥區(qū)因缺少適合田間表型鑒定的氣候條件，所以赤霉病抗性品種的篩選難度更大。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)可以大大提高赤霉病抗性品種的培育速度。Fhb1是目前為止報道的效應(yīng)最大的赤霉病抗性基因，前人一直致力于Fhb1基因的克隆和標(biāo)記開發(fā)以服務(wù)于小麥抗赤霉病育種[6，12-19]。本研究利用Su等[19]開發(fā)的Fhb1基因的KASP標(biāo)記TaHRC-Kasp對來自黃淮冬麥區(qū)(河北、河南、山東、陜西)和江蘇、安徽的共336份小麥材料進(jìn)行檢測，共檢測出5份攜帶Fhb1基因的品種，其中有2份是來自河北省的品種石家莊75和紫莖白，其余3份為來自江蘇省的蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13，這3份材料是公認(rèn)的攜帶Fhb1基因的品種。有3份材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)表現(xiàn)為Fhb1雜合基因型，其余材料為Fhb1-基因型。為了驗證KASP標(biāo)記檢測結(jié)果，本研究挑選了24份材料利用朱展望等[6]開發(fā)的His-InDel標(biāo)記做進(jìn)一步檢測。His-InDel標(biāo)記與KASP標(biāo)記檢測結(jié)果基本一致，但寧豐518品種KASP檢測為Fhb1-基因型，而His-InDel標(biāo)記檢測為Fhb1+基因型；德宏福6號和泊麥7號2份材料KASP檢測為雜合類型，而His-InDel標(biāo)記檢測為Fhb1-基因型，這可能是受KASP標(biāo)記檢測的特異性或熒光信號的偏差所影響。KASP標(biāo)記由于檢測速度快、通量高，已廣泛應(yīng)用于作物分子標(biāo)記輔助育種。從本研究結(jié)果看，TaHRC-Kasp標(biāo)記基因分型清晰，檢測準(zhǔn)確性也較高，將TaHRC-Kasp標(biāo)記和His-InDel標(biāo)記結(jié)合使用可以大大提高小麥抗赤霉病育種效率。

Fhb1基因在我國江蘇、安徽等赤霉病重發(fā)區(qū)已得到廣泛應(yīng)用，并且在北美和日本應(yīng)用也較為廣泛[18，20-21]。研究表明，中國小麥品種所含F(xiàn)hb1基因主要有2個來源，分別為蘇麥3號和寧麥9號，利用蘇麥3號在長江中下游麥區(qū)育成了寧7840等品種，利用寧麥9號培育成了寧麥系列品種(如寧麥13、寧麥14、寧麥26等)和揚(yáng)麥系列品種(如揚(yáng)麥18、揚(yáng)麥21等)[6]。隨著近年來黃淮麥區(qū)赤霉病呈加重趨勢，提高小麥赤霉病抗性已成為黃淮南片麥區(qū)主要育種目標(biāo)之一，但Fhb1基因在黃淮麥區(qū)的應(yīng)用相對緩慢，目前尚無攜帶Fhb1基因的小麥品種報道。究其原因一則可能與黃淮麥區(qū)抗赤霉病育種時間較短有關(guān)，二則可能是由于Fhb1基因與某些不利農(nóng)藝性狀連鎖較緊密[6]，導(dǎo)致在育種進(jìn)程中Fhb1基因受到人工選擇壓力而被去除。有研究表明，F(xiàn)hb1+基因型與稈銹病基因Sr2-基因型緊密連鎖[22]，在很大程度上限制了Fhb1基因的應(yīng)用，本研究也發(fā)現(xiàn)6個Fhb1+基因型品種(石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13和寧豐518)不攜帶Sr2抗性基因。由于光溫等氣候條件的差異，長江中下游春麥區(qū)的抗赤霉病小麥品種很難在黃淮冬麥區(qū)直接應(yīng)用，因此，在黃淮冬麥區(qū)篩選攜帶Fhb1基因的種質(zhì)材料對黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病小麥育種尤為重要。本研究利用TaHRC-Kasp和His-InDel標(biāo)記篩選出2個來自河北省的材料(石家莊75和紫莖白)攜帶Fhb1基因。His基因序列分析也顯示石家莊75、紫莖白和蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13、寧豐518的序列一致，為抗赤霉病類型；鄭麥9023、小偃22、矮抗58、泊麥7號等為感赤霉病類型。小麥品種石家莊75的親本組合為“矮立多/碧玉麥//安徽5號”，矮立多(Ardito)是從意大利引進(jìn)的品種，碧玉麥(Quality)是20世紀(jì)40年代初從美國引進(jìn)的春麥材料，矮立多和碧玉麥不具有Fhb1基因。安徽5號的親本為南大2419和勝利麥。南大2419是從1932年引入的意大利品種Mentana中混選出來的，勝利麥?zhǔn)墙▏跗诘霓r(nóng)家品種。南大2419是Fhb1-材料，所以，石家莊75中的Fhb1基因有可能是來源于勝利麥，但這還需進(jìn)行進(jìn)一步驗證核實。紫莖白是河北省的地方農(nóng)家種，其攜帶Fhb1基因，這說明最初Fhb1基因在國內(nèi)一些地方品種中有所分布(如望水白、白三月黃、黃方柱、火燒麥、火燒白日麥和菜籽黃等)[23-26]，但在現(xiàn)代育種進(jìn)程中受到人工選擇的壓力而逐漸消失。

經(jīng)TaHRC-Kasp和His-InDel標(biāo)記檢測和His基因序列分析，證明來自河北省的2份小麥材料石家莊75和紫莖白攜帶Fhb1基因。TaHRC-Kasp和His-InDel標(biāo)記聯(lián)合使用進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可以大大提高抗赤霉病小麥育種效率。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所何中虎研究員、夏先春研究員在Fhb1基因KASP標(biāo)記檢測過程中提供的幫助，感謝湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所朱展望博士提供His-InDel標(biāo)記信息。