劉新輝，馬小嶺，季秋紅

(1.山東拜爾檢測(cè)股份有限公司，山東 濰坊261000；2.山東匠造檢測(cè)有限公司，山東 濰坊，261000)

β-受體激動(dòng)劑屬于苯乙醇胺類(lèi)藥物，是兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的化學(xué)類(lèi)似物，主要有克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、非諾特羅、西布特羅、氯丙那林、西馬特羅、馬布特羅、馬噴特羅、溴布特羅、噴布特羅等。這類(lèi)藥物對(duì)心腦血管疾病、糖尿病、冠心病、甲狀腺功能亢進(jìn)、青光眼、前列腺肥大者有不良影響；另外，孕婦中毒可導(dǎo)致癌變、胎兒致畸。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019“整頓辦函〔2010〕50號(hào)”規(guī)定β-受體激動(dòng)劑屬于禁止用于所有食品動(dòng)物的獸藥。喹諾酮是以1,4-二氫-4-氧吡啶-3-羧酸為基本母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，是從萘啶酸或吡酮酸演化而來(lái)的合成抗菌藥物，主要有洛美沙星、氟甲喹、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、伊諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星等。動(dòng)物性食品中殘留較低濃度的藥物容易誘導(dǎo)人類(lèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性；在較高劑量下，出現(xiàn)站立不穩(wěn)、煩躁不安、嗜睡等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。2015年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(原農(nóng)業(yè)部)發(fā)布的第2292號(hào)公告中禁止將洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種喹諾酮類(lèi)抗菌藥物用于食品動(dòng)物。目前測(cè)定β-受體激動(dòng)劑類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物的方法有光譜分析、免疫分析[1]、生物傳感器技術(shù)、毛細(xì)管電泳法[2]、氣相色譜法[3]、液相色譜法[4]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)β-受體激動(dòng)劑類(lèi)的色譜檢測(cè)方法均需經(jīng)過(guò)酶解，酶解時(shí)間需12 h以上[5-6]，且萃取試劑較為復(fù)雜，重現(xiàn)性差。本研究采用酸水解法，前處理時(shí)間短，成本低，抗干擾能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)β-受體激動(dòng)劑類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物的準(zhǔn)確定性和定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cleanert LipoNo購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨、甲酸均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)CNW公司；氯化鈉為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；克倫特羅(批號(hào)50223)、非諾特羅(批號(hào)40618AL)、洛美沙星(批號(hào)115068)、氟甲喹(批號(hào)40110)、環(huán)丙沙星(批號(hào)41006)、達(dá)氟沙星(批號(hào)40428)、伊諾沙星(批號(hào)30913)、氟羅沙星(批號(hào)40505)、諾氟沙星(批號(hào)41015)、氧氟沙星(批號(hào)21016)、培氟沙星(批號(hào)40716)購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrensorfer標(biāo)準(zhǔn)品公司；西布特羅(批號(hào)271542)、西馬特羅(批號(hào)292231)、馬布特羅(批號(hào)120805)、諾氟沙星-D5(批號(hào)291528)、環(huán)丙沙星-D8(批號(hào)231722)購(gòu)自德國(guó)WITEGA標(biāo)準(zhǔn)品公司；沙丁胺醇(批號(hào)170714)、萊克多巴胺(批號(hào)170303)、特布他林(批號(hào)B0002575)、氯丙那林(批號(hào)B0001425)、馬噴特羅(批號(hào)160414)、溴布特羅(批號(hào)160414)、噴布特羅(批號(hào)24731)、克倫特羅-D9(批號(hào)160414)、萊克多巴胺-D6(批號(hào)170427)、沙丁胺醇-D3(批號(hào)170222)、氧氟沙星-D3(批號(hào)160713)購(gòu)自北京曼哈格生物科技有限公司；恩諾沙星(批號(hào)A1808204)、沙拉沙星(批號(hào)A1806133)購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；恩諾沙星-D5(批號(hào)NY1701036a)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290Ⅱ-6460QQQ (配有電噴霧離子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國(guó)Agilent公司；AS-E40UVT-R純水儀，重慶奧思德儀器設(shè)備有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱(chēng)取12種激動(dòng)劑、11種喹諾酮及7種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg(精確到0.01 mg)用甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃下保存待用；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從上述單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各吸取1 mL溶液于50 mL容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為20 mg/L的混合儲(chǔ)備液，吸取混合儲(chǔ)備液250 μL于50 mL容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為100 Hg/L的混合工作液，于4 ℃下避光保存；按同樣方式將7種內(nèi)標(biāo)稀釋為100 Hg/L的混合內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3.0×100 mm，1.8-Micron)；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，B為甲醇(含0.1%甲酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù))；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；采用梯度洗脫程序：0～2 min，10%B；2～3 min，10%～60%B；3～4 min，60%B；4～5 min，60%～90%B；5～7 min，90%B；7～8 min，90%～10%B；8～10 min，10%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)，干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為9 L/min，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為10 L/min，霧化器壓力為27.6 Pa。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分析，正離子掃描，具體的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 23種獸藥及7種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)條件
Table 1 The mass spectrometric detection conditions for 23 veterinary drugs and seven internal standard materials

名稱(chēng)離子對(duì)m/z碎裂電壓/V碰撞能量/eV克倫特羅 277.1/259.1*,277.1/2031005,12萊克多巴胺302/164.1*,302/12111010,22沙丁胺醇 240/222.1*,240/1481005,13西馬特羅 220.1/202.1*,220.1/160.11005,13馬布特羅 311.1/293*,311.1/2371105,13馬噴特羅 325.1/237*,325.1/21711013,13特步他林 226.1/152.1*,226.1/1079010,25非諾特羅 304.1/286.2*,304.1/135.21208,15噴布特羅 292.1/236.2*,292.1/20111012,20西布特羅 234/160*,234/14310010,30溴布特羅 367/212*,367/29312020,15氯丙那林 214.1/196.1*,214.1/15805,13恩諾沙星 360/342.1*,360/316.212020,20諾氟沙星 320/302.1*,320/276.113020,15沙拉沙星 386.1/368.1*,386.1/342.113020,15環(huán)丙沙星 332.1/314.1*,332.1/23113520,42氧氟沙星 362/318.1*,362/261.113015,26洛美沙星 352.1/308.1*,352.1/265.113010,20丹諾沙星 358.1/340.1*,358.1/25514025,46培氟沙星 334.1/316.2*,334.1/290.213020,16氟甲喹 262/126*,262/20210050,30依諾沙星 321/303.2*,321/232.112520,36氟羅沙星 370.1/269*,370.1/32613025,15克倫特羅-D9286.1/204.110013萊克多巴胺-D6307.2/167.110013沙丁胺醇-D3243.2/151.210015環(huán)丙沙星-D8340.2/322.213518恩諾沙星-D5365.2/261.113026氧氟沙星-D3365.2/321.212018諾氟沙星-D5325.1/307.213017

注：碎片離子中標(biāo)*為定量離子。

1.4.3 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g樣品(精確至0.01 g)放入50 mL離心管中，加入5 mL 1%乙酸水溶液，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL，旋渦混勻10 min。加入10 mL乙腈，于振蕩器上劇烈震蕩30 min，再加入2 g氯化鈉，旋渦混勻2 min，在8 000 r/min條件下離心5 min。

凈化：移取5 mL上清液于Cleanert LipoNo凈化管中，旋渦混勻2 min，靜置分層。移取2 mL上清液在50 ℃下氮?dú)獯蹈桑捎? mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選取

結(jié)合以往的研究經(jīng)驗(yàn)，考察了1%乙酸水-乙腈、1%乙酸乙腈[7]、1%鹽酸乙腈、乙腈4種提取溶劑，得到回收率及精密度。結(jié)果顯示：通過(guò)1%乙酸水-乙腈作提取溶劑，樣品分散效果最好，先加乙酸水后加乙腈的提取方式，避免了樣品因蛋白質(zhì)變性而發(fā)生凝結(jié)的現(xiàn)象[8]，故回收率和精密度效果最好。乙腈的回收率和精密度最低，分析原因是缺少酸解，目標(biāo)物無(wú)法從軛合物形態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，且乙腈會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性凝結(jié)，部分目標(biāo)物無(wú)法充分釋放；采用1%乙酸乙腈和1%鹽酸乙腈提取，同樣會(huì)發(fā)生凝結(jié)，回收率比乙腈稍高，但低于1%乙酸水-乙腈的提取方式。

2.2 凈化方法的確定

比較了Cleanert LipoNo、C18和PSA[9]、乙腈飽和正己烷3種凈化方式。Cleanert LipoNo為大顆粒填料，無(wú)需離心，操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化，對(duì)甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯均有良好的吸附效果，比其他填料具有更好的去除脂類(lèi)物質(zhì)的性能；C18和PSA能吸附油脂和有機(jī)酸[10]，但需要經(jīng)過(guò)離心，且復(fù)溶液澄清度低，重現(xiàn)性差；因動(dòng)物源性食品的提取液中含有大量油脂及蛋白，利用乙腈飽和正己烷凈化，易發(fā)生乳化現(xiàn)象[11-12]，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)物經(jīng)色譜分離時(shí)，流動(dòng)相、進(jìn)樣介質(zhì)及體系均會(huì)影響色譜峰型[13]，使用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，化合物色譜峰會(huì)展寬、拖尾、靈敏度降低，在水相中加入乙酸銨和甲酸后可改善目標(biāo)物的峰型[14]，促進(jìn)目標(biāo)物的離子化[15]，因此，選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.1%甲酸)為最佳流動(dòng)相[16]。23種目標(biāo)物及7種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)在10 min內(nèi)完成，結(jié)果顯示在既定時(shí)間內(nèi)所有目標(biāo)化合物均出現(xiàn)峰值，且峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，進(jìn)樣分析時(shí)間短，分離度滿足要求[17-18]。

2.4 方法學(xué)考察

線性范圍與定量限：完成前處理與儀器測(cè)定的優(yōu)化后，可據(jù)此配制混合工作液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，X軸設(shè)定為質(zhì)量濃度，Y軸設(shè)定為峰面積，由此完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制并進(jìn)行線性回歸。所得結(jié)果表明23種獸藥的質(zhì)量濃度范圍為0.5～20 Hg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R取值范圍為0.996 2～0.999 9，具備實(shí)驗(yàn)的可行性；同時(shí)，以S/N≥10(信噪比≥10)確定方法的定量限質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.43～1.02)μg/kg，具體結(jié)果如表2所示。

方法的準(zhǔn)確度與精密度：選取陰性樣品基質(zhì)，將配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5，1.0和2.5 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中，按照確定的提取、凈化方法在選定的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算所得平均回收率為80.2%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.52%～9.52%，滿足了復(fù)雜樣品基質(zhì)中高通量痕量殘留檢測(cè)需求[19]。

表2 23種獸藥的相關(guān)系數(shù)、定量限與回收率
Table 2 Related coefficient,quantitative limit and recovery rate of 10 veterinary drugs

名稱(chēng)RLOQ/(μg/kg)加標(biāo)量0.5 μg/kg回收率/%RSD/%加標(biāo)量1.0 μg/kg回收率/%RSD/%加標(biāo)量2.5 μg/kg回收率/%RSD/%克倫特羅0.998 90.4395.62.0695.33.3391.95.11萊克多巴胺0.996 90.4894.81.2299.62.9897.41.29沙丁胺醇0.997 40.4896.52.0598.77.15102.65.02西馬特羅0.998 10.4989.38.0789.60.5295.23.96馬布特羅0.996 70.5090.19.0786.92.8789.98.20馬噴特羅0.997 50.5080.25.5190.73.8591.63.40特布他林0.998 00.4883.66.0088.71.5988.55.26非諾特羅0.998 60.49105.18.4193.24.9890.63.21噴布特羅0.996 80.5092.94.4584.65.2689.91.09西布特羅0.999 10.4888.56.0290.87.5190.52.22溴布特羅0.998 70.5097.33.4182.95.8294.82.56氯丙那林0.997 60.5096.21.5892.86.4191.73.65恩諾沙星0.997 60.80100.22.2995.62.8596.90.95諾氟沙星0.999 01.0298.63.8594.81.9198.71.23沙拉沙星0.997 31.00109.24.47105.77.6296.96.54環(huán)丙沙星0.991 40.80101.36.0994.31.0196.52.25氧氟沙星0.987 10.8590.65.8888.82.0597.63.96洛美沙星0.991 90.9088.27.0684.18.7590.35.62丹諾沙星0.980 51.0085.32.4190.26.9591.82.65培氟沙星0.986 31.0092.76.8591.84.1888.87.41氟甲喹0.969 71.0087.25.4192.63.9693.94.98依諾沙星0.981 71.0091.63.9593.15.8198.63.85氟羅沙星0.986 51.0093.54.82106.03.4090.59.52

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)10種不同的動(dòng)物源性食品，根據(jù)上述方法對(duì)其進(jìn)行UHPLC-MS/MS測(cè)定，檢出項(xiàng)目結(jié)果如表3所示，雞肉、鴨肉、鯽魚(yú)、草魚(yú)等4種動(dòng)物源性食品中均含有恩諾沙星，根據(jù)GB 31650—2019的相關(guān)規(guī)定，恩諾沙星(以恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和計(jì))在動(dòng)物肌肉中的限量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/kg，而實(shí)測(cè)結(jié)果顯示鯽魚(yú)、草魚(yú)中恩諾沙星的殘留量分別為132，103 μg/kg，均超出最大殘留限量；克倫特羅為禁止檢出的藥物，依據(jù)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)定量限在0.5 μg/kg，但檢測(cè)結(jié)果該種獸藥在羊肉中的殘留量為0.92 μg/kg，也存有超標(biāo)現(xiàn)象。這說(shuō)明在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過(guò)程中應(yīng)控制相應(yīng)喹諾酮類(lèi)藥物的使用量；而克倫特羅屬于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明文規(guī)定禁止用于所有食品動(dòng)物的獸藥，在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)禁止添加β-受體激動(dòng)劑的藥物。標(biāo)準(zhǔn)品、雞肉樣品、羊肉樣品的總離子流圖(TIC)分別如圖1～3所示；西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇、西布特羅、非諾特羅、氟羅沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、萊克多巴胺、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丹諾沙星、洛美沙星、氯丙那林、沙拉沙星、克倫特羅、溴布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、氟甲喹、噴布特羅的色譜圖及質(zhì)譜圖如圖4所示。

表3 10種樣品的UHPLC-MS/MS檢出項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果Table 3 UHPLC-MS/MS test results of 10 samples μg/kg

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig.1 TIC of standard products

圖2 雞肉樣品總離子流圖Fig.2 TIC of chicken sample

圖3 羊肉樣品總離子流圖Fig.3 TIC of mutton sample

圖4 23種獸藥的色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.4 Chromatography and mass spectrograph of 23 veterinary drugs

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、凈化方法和流動(dòng)相條件，建立了動(dòng)物源性食品中的12種β-受體激動(dòng)劑類(lèi)和11種喹諾酮類(lèi)物質(zhì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，操作簡(jiǎn)便，成本低，抗干擾能力強(qiáng)，重現(xiàn)性高，靈敏度高，選擇性強(qiáng)。