陳瓊,吳菲菲,李化強,劉亞美,王恒震,張早明

(邵陽學院 食品與化學工程學院,湖南 邵陽,422000)

杠板歸(polygonumperfoliatumL)是湖南特色中藥材,又名犁頭刺、貫葉蓼、蛇不過等,屬于蓼科蓼屬(polygonaceae),收載于《中華人民共和國藥典》一部(2010年版)[1],杠板歸是我們生活中常見的一種中草藥[2],有研究表明,杠板歸具有多種生物活性成分,主要有酚類、黃酮類、揮發(fā)油、蒽醌等[3-4]。其中多酚類化合物在清熱解毒、利水消腫、蛇蟲咬傷等方面起著不可或缺的作用,是杠板歸中一種重要的生物活性物質[5-8]。目前,杠板歸的研究主要集中在多糖和黃酮的提取及其藥理作用[9-11],幾乎沒有關于杠板歸多酚提取的報道。多酚的方法主要有機溶劑回流法、超聲輔助提取法、酶法及超臨界流體萃取法等[12-14]。而超聲結合表面活性劑提取方法,主要是利用超聲非熱加工的特點,與表面活性劑的潤濕、增溶作用相結合,達到節(jié)能省時、提高含量等效果,更有利于活性成分的溶出[15-17]。本試驗中采用超聲與吐溫80協(xié)同提取法,通過正交試驗優(yōu)選杠板歸多酚的提取工藝條件,并研究其體外抗氧化活性,為杠板歸作為藥食同源的開發(fā)應用潛力提供理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杠板歸:邵陽本地大藥房,粉碎過80目(0.180 mm)篩備用；

沒食子酸標準品、Folin-Ciocalteu試劑、抗壞血酸、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺為分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司；

吐溫80、亞硝酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸為分析純,邵陽市科儀玻化有限公司。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機:FW400A型,北京科偉永興儀器有限公司；

真空冷凍干燥機:SCIENTZ-18N型,寧波新芝生物科技股份有限公司；

真空旋轉蒸發(fā)儀:RE-5299型,鞏義市予華儀器有限責任公司；

超聲波清洗機:SB5200DTD型,寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計:UV-1780型,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 杠板歸預處理及提取工藝

精密稱取2 g(精確到0.000 1 g)的杠板歸粉末置于100 mL的錐形瓶中,再加入一定量的吐溫80水溶液進行超聲提取,于10 000 r/min的條件下離心10 min后得上清液,過濾,合并濾液,得到待測液備用。

1.3.2 總酚含量的測定

1)沒食子酸標準曲線的制定。以沒食子酸為對照品,采用Folin-Ciocalteu法[18]測定多酚質量分數(shù)。在765 nm波長處測定吸光度,繪制沒食子酸質量濃度(X)與吸光度(Y)的標準曲線。線性回歸方程為Y=5.457 1X-0.007 9(R2=0.997 9),線性相關性良好。

2)樣品中總酚質量分數(shù)的測定。按照標準曲線制作法測定吸光度,根據(jù)方程計算杠板歸多酚得率。計算公式:

總酚得率=(C×V×n)/1 000/m×100%

式中:C為根據(jù)回歸方程計算得到的質量濃度，g/L；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為杠板歸粉末的質量，g。

1.3.3 單因素實驗設計

單因素實驗探究了5個因素對杠板歸多酚得率的影響,其中超聲溫度分別為40，50，60，70和80 ℃；吐溫80質量濃度分別為10%，15%，20%，25%和30%；超聲功率分別為150，180，210，240和270 W；液料比分別為10∶1 ，15∶1 ，20∶1 ，25∶1和30∶1 mL/g；超聲時間分別為20，30，40，50和60 min。實驗指標為杠板歸多酚得率,每個重復3次。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上,考察液料比(A)、超聲時間(B)、吐溫80質量濃度(C)、超聲功率(D)、超聲溫度(E)5個因素,以多酚得率為指標進行正交試驗,確定杠板歸多酚的最佳提取工藝條件。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素及水平
Table 1 Orthogonal test factors and levels

水平A液料比/(mL·g-1)B超聲時間/minC吐溫80質量濃度/%D超聲功率/WE超聲溫度/℃110∶1201015040215∶1301518050320∶1402021060425∶1502524070

1.3.5 體外抗氧化活性研究

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲溫度

超聲溫度對多酚得率的影響見圖1。圖1表明：在40～80 ℃的范圍內,多酚得率先逐漸升高,隨著溫度的逐漸升高，各物質之間的運動速度增大,吐溫80水溶液滲透到杠板歸原料內的能力和多酚的溶解度增大,增加了多酚得率；而當提取溫度過高時,其熱不穩(wěn)定性使多酚的化學結構遭到破壞,從而導致多酚得率下降。因此,確定60 ℃為較佳的提取超聲溫度。

圖1 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polyphenols

圖2 吐溫80質量濃度對多酚得率的影響Fig.2 Effect of Tween 80 concentration on the extraction rate of polyphenols

2.1.2 吐溫80質量濃度

吐溫80質量濃度對多酚得率的影響見圖2。圖2表明：在吐溫質量濃度為10%～20%時,多酚得率隨著吐溫80質量濃度的增加而呈現(xiàn)增大的趨勢,這是由于吐溫80作為增溶劑,更有利于多酚的溶出；但當質量濃度大于20%時,得率開始呈下降趨勢,原因可能是當質量濃度過高時形成了膠束,多酚物質進入膠束中后再溶出受阻,導致多酚得率下降[22]。因此,確定20%為較佳的提取吐溫80質量濃度。

2.1.3 超聲功率

超聲功率對多酚得率的影響見圖3。圖3表明：在150～270 W范圍內,隨著超聲功率增大,杠板歸多酚得率緩慢升高。這是由于超聲波提取主要是利用超聲波的特性,如溫熱效應使能量轉換、物理化學變化等等,此時分子運動速度增大,從而加速多酚溶出,提高了多酚得率[23]。多酚得率在超聲功率達到180 W時達到最高。因此,確定180 W為較佳的提取超聲功率。

圖3 超聲功率對多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polyphenols

2.1.4 液料比

液料比對多酚得率的影響見圖4。圖4表明：在液料比為10∶1～30∶1 mL/g時,隨著液料比的增大,杠板歸多酚的得率先增后降,15∶1 mL/g時達到最大值。這可能是由于料液比較低時,原料和吐溫80水溶液接觸不充分,導致細胞中的多酚不易溶出；當體系中的溶劑量過多時,會降低超聲波的超聲效果,同時樣品在后處理濃縮過程中多酚的損失增加[24]。因此,確定15∶1 mL/g為較佳的提取液料比。

圖4 液料比對多酚得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on the extraction rate of polyphenols

圖5 超聲時間對多酚得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polyphenols

2.1.5 超聲時間

超聲時間對多酚得率的影響見圖5。圖5表明：在超聲時間20～60 min范圍內,隨著超聲時間的增加，多酚得率增加,在40 min時多酚的溶出量最大,提取效果最好,超聲波對物料的作用較充分；之后再延長提取時間,多酚得率反而下降,超聲波較強的剪切作用會破壞多酚的分子結構[25-26],并且多酚與外界環(huán)境接觸時間過長也會導致氧化和分解[27]。因此,確定40 min為較佳的提取超聲時間。

2.2 正交試驗設計及結果

正交實驗設計及結果見表2。

表2 正交實驗設計及結果
Table 2 Design and results of orthogonal experiments

試驗號ABCDE多酚得率/%11111116.9821222217.3131333317.5341444418.6352123417.1462214318.2272341218.0382432116.9793134218.53103243117.94113312418.11123421318.14134142317.54144231419.16154324118.09164413217.54K117.61317.54717.71218.07817.495K217.59018.15717.67017.48317.852K318.18017.94018.04717.53817.858K418.08317.82018.03518.36718.260R0.5900.6100.3770.8840.765最優(yōu)方案A3B2C3D4E4

由表2看出各個單因素對杠板歸中多酚得率的影響順序為：D>E>B>A>C即超聲功率>超聲溫度>超聲時間>液料比>吐溫80質量濃度。提取最佳工藝條件為A3B2C3D4E4,即液料比為20∶1 mL/g，超聲時間為30 min，吐溫80質量濃度為20%，超聲溫度為70 ℃，超聲功率為240 W。

2.3 正交實驗驗證結果

根據(jù)正交實驗中得到的最佳提取方案再次進行杠板歸多酚的提取來驗證實驗結果。結果表明：當多酚提取效果高于以上16個試驗組合時,多酚得率為(19.87±0.17)%,在此工藝條件下重復性好,穩(wěn)定可行。

2.4 DPPH自由基清除能力的測定

多酚對DPPH自由基的清除能力見圖6。由圖6可知：杠板歸多酚提取物(PPP)和VC都有清除DPPH自由基的作用；隨著其質量濃度的不斷增大,兩者對DPPH自由基的清除能力隨之逐漸增強最后趨于穩(wěn)定；在質量濃度為30～150 mg/L時,杠板歸多酚提取物對DPPH自由基的清除率最大達到73.34%,從整體來看,杠板歸多酚提取物對DPPH自由基的清除能力強于VC。

圖6 多酚對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of polyphenols on DPPH radicals

圖7 多酚對自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of polyphenols on radicals

2.6 總還原能力的測定

先前已有報道,抗氧化活性與植物提取物的還原能力之間存在直接關聯(lián),化合物的還原能力可作為其潛在抗氧化活性的重要指標[28]。杠板歸多酚提取物(PPP)和VC的還原能力如圖8所示。從圖8可見：在多酚質量濃度為30～150 mg/L時,隨著多酚質量濃度的不斷增大,兩者的還原能力相應提高,且多酚提取物的還原能力大于同質量濃度的VC還原能力。從整體來看,杠板歸多酚提取物的總還原能力強于VC。

圖8 多酚的總還原能力Fig.8 Total reducing power of polyphenols

3 結論

杠板歸多酚的最佳提取條件如下：液料比為20∶1 mL/g，超聲時間為30 min，吐溫80質量濃度為20%，超聲溫度為70 ℃、超聲功率為240 W,在此條件下,多酚得率達到(19.87±0.17)%。杠板歸多酚提取物具有較強的抗氧化活性,且清除效果與質量濃度相關,在相同質量濃度下，杠板歸多酚提取物對DPPH自由基的清除率及總還原能力優(yōu)于陽性對照VC。下一步還需對其進行分離純化,對其結構、活性的研究深入探索,以鑒定出抗氧化的主要活性化合物。