斑馬魚心臟損傷模型的建立及桔梗提取物對其心臟損傷的干預作用研究

史有陽 郝 煒 吳春宇 韓向暉 楊 瑞 孫霃平 劉 勝

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中西醫(yī)結合乳腺科，上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)外科研究所，上海200032）

阿霉素是蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，臨床上廣泛用于治療惡性腫瘤，具有高效、廣譜的特點，但其多種毒副反應特別是心臟毒性使其在臨床應用上受到限制[1]。課題組前期臨床研究表明，中藥桔梗能夠改善乳腺癌患者阿霉素化療后心臟毒性，提高患者心臟射血功能[2]。本實驗選用心臟特異表達綠色熒光轉基因Tg（cmlc2：EGFP）斑馬魚，借助熒光顯微鏡可以全程觀察其心臟發(fā)育及血液流動狀況[3-4]。通過不同濃度的阿霉素干預，建立阿霉素誘導的斑馬魚心臟損傷模型，并進一步觀察桔梗提取物對阿霉素誘導的斑馬魚心臟損傷的干預作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 心臟特異表達綠色熒光轉基因Tg（cmlc2：EGFP）斑馬魚由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實驗平臺提供，實驗全程遵循斑馬魚實驗平臺實驗動物福利與倫理要求，研究通過動物倫理委員會批準。實驗前一晚將成年雌雄斑馬魚按1∶2 配對，放入帶隔板的產卵盒中，第2 天早晨抽掉隔板。產卵完成1 h后，用吸管將魚卵收集于含有胚胎培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中，清洗魚卵數次除去未受精卵、糞便等雜物，將發(fā)育完整的受精卵放于28.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每24 h換液1次。

1.2 藥品、試劑與儀器 阿霉素（購自碧云天生物技術有限公司，貨號SC0159）；中藥桔梗飲片（購自上海養(yǎng)和堂飲片有限公司，批號171012）；木犀草素（購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-17102605）；普 通 倒 置 顯 微 鏡（SMZ745，Nikon）；熒光倒置顯微鏡（SMZ18，Nikon）；微量電子分析天平（BAS224S，德國Startotius）；安捷倫Agilent 1260 Infinity液 相 色 譜 儀（美 國Agilent）；N-1300D-WB型旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 稱取桔梗飲片10.0 g，加入120 mL 70%乙醇溶液浸泡4 h后回流提取1 h，過濾，收集濾液。重復2 次后合并濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮至1 g/mL，過0.45 μm微孔濾膜，收集濾液，-20 ℃分裝保存，用時稀釋至所需濃度。同時，通過高效液相色譜（HPLC）檢測，測定桔梗提取物中木犀草素含量為2.85 mg/g，符合質量標準，色圖譜見圖1。

圖1 桔梗提取物高效液相色譜圖

2.2 阿霉素誘導斑馬魚心臟損傷模型的建立 選取發(fā)育正常，受精后48 h的斑馬魚20 條，放置于24孔板中，隨機分為4 組，分別為正常組和阿霉素低、中、高 劑 量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）組，每組5 條。各組斑馬魚放入28.5 ℃的培養(yǎng)箱中，分別加入含不同濃度阿霉素的胚胎培養(yǎng)液，正常組加入不含阿霉素的胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。普通倒置顯微鏡觀察各組斑馬魚心臟形態(tài)，計算生存率。將各組斑馬魚放于4%甲基纖維素中，擺放于側臥位，熒光倒置顯微鏡下觀察，記錄心率，測量靜脈竇-動脈球（SV-BA）距離。最終選擇合適濃度的阿霉素，以建立斑馬魚心臟損傷模型。

2.3 斑馬魚對桔梗提取物的耐受試驗 選取160條狀態(tài)良好，受精后48 h的斑馬魚放入24孔板中，隨機分為8組，每組20條。采用等比濃度梯度稀釋法，用胚胎培養(yǎng)液稀釋桔梗提取物至20、40、80、160、320、640、1 280 μg/mL，以空白培養(yǎng)液為對照組。加藥完成后放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察斑馬魚的生存情況，計算生存率。

2.4 桔梗提取物對阿霉素誘導的斑馬魚心臟損傷的影響 選取25條發(fā)育正常，受精后48 h的斑馬魚放入24孔板中，隨機分為5組，分別為正常組、模型組和桔梗提取物低（20 μg/mL）、中（40 μg/mL）、高（80 μg/mL）劑量組，每組5條。除正常組外，其余各組斑馬魚使用阿霉素制作心臟損傷模型。造模后分別予相應濃度的桔梗提取物干預24 h，使用普通倒置顯微鏡觀察各組斑馬魚心臟形態(tài)，使用熒光倒置顯微鏡觀察斑馬魚心臟收縮和舒張形態(tài)，記錄和計算各項心臟功能指標，包括心率、SV-BA距離、每搏輸出量、心輸出量。

2.5 統計學方法 運用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，實驗數據以（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 斑馬魚心臟損傷模型制作中阿霉素用量 經低、中、高劑量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）阿霉素及不使用阿霉素作用24 h，斑馬魚生存率均為100%。正常組斑馬魚活動力強，無心包水腫；中、高劑量阿霉素干預24 h后，斑馬魚活動力受到抑制，心房、心室逐漸變大，出現不同程度的心包水腫，其中高劑量阿霉素組斑馬魚心包水腫尤為嚴重。見圖2。與正常組斑馬魚相比，中、高劑量阿霉素組斑馬魚心率明顯下降（P＜0.05）、SV-BA距離顯著增大（P＜0.05），見表1?？紤]10 μmol/L阿霉素毒性適中，故后續(xù)實驗選取10 μmol/L阿霉素誘導斑馬魚心臟損傷，建立心臟損傷模型。

圖2 阿霉素干預后各組斑馬魚心包及心臟表型比較

3.2 桔梗提取物對斑馬魚的安全劑量 桔梗提取物1 280 μg/mL組斑馬魚全部死亡，640、320、160、80、40、20 μg/mL組 斑 馬魚存活率分別為90.0%、100.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、100.0%。斑馬魚對桔梗提取物的最大耐受劑量為320 μg/mL。因此，在安全劑量范圍內選擇20、40、80 μg/mL這3個濃度進行后續(xù)實驗。

3.3 桔梗提取物對阿霉素誘導的斑馬魚心臟損傷的影響 與正常組比較，模型組斑馬魚心包出現水腫；與模型組比較，中、高劑量桔梗提取物干預24 h后，斑馬魚心包水腫減輕。見圖3。與正常組比較，模型組斑馬魚心率明顯降低（P＜0.05），SV-BA距離增大（P＜0.05），每搏輸出量、心輸出量均顯著降低（P＜0.05）。經中、高劑量桔梗提取物干預24 h，斑馬魚心率較模型組明顯增加（P＜0.05），SV-BA距離變短（P＜0.05），每搏輸出量、心輸出量均有效提高（P＜0.05）。見表2。

4 討論

斑馬魚（zebrafish），個體長約3～4 cm，具有繁殖速度快，喂養(yǎng)簡單，容易大規(guī)模飼養(yǎng)的特點。斑馬魚作為新型模式動物的優(yōu)勢正在逐漸被人們認識，其基因與人類基因的相似度達87%[5]。近年來斑馬魚模型已廣泛用于中藥毒性成分、有效物質篩選及藥物代謝研究[6]。斑馬魚早期胚胎透明，發(fā)育24 h時即可出現心跳，發(fā)育48 h時心臟已形成并具有完整功能，借助顯微鏡可以方便觀察藥物對心臟的毒性作用。

桔梗味苦、辛，性平，歸肺經，具有宣肺、祛痰、利咽、排膿的功效?！渡褶r本草經》記載，桔梗“主胸脅痛如刀刺，腹?jié)M腸鳴幽幽，驚恐悸氣”[7]?，F代藥理研究也發(fā)現，桔梗及其有效活性物質具有心臟保護[8]、抗腫瘤[9-10]、抗炎[11]、預防缺血再灌注損傷的功效[12]。YU等[13]發(fā)現桔梗內活性成分木犀草素具有預防心肌缺血再灌注損傷的作用，其機制可能與降低心肌細胞氧化應激水平，減少活性氧生成，抑制線粒體凋亡信號通路激活途徑有關。LIN等[14]研究表明，桔梗提取物可通過抑制IGF-IIR表達從而逆轉血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡。

表1 不同濃度阿霉素干預后斑馬魚心臟功能比較（x-±s）

圖3 各組斑馬魚心包及心臟表型比較

表2 各組斑馬魚心臟功能比較（x-±s）

本研究選用心臟特異表達綠色熒光的轉基因（cmlc2：EGFP）斑馬魚作為實驗動物，通過觀察斑馬魚心臟表型，測量SV-BA距離，計算心率、每搏輸出量、心輸出量等心臟指標進行整體毒性評估。靜脈竇和動脈球之間的距離可反映心房和心室的位置變化。我們發(fā)現10、20 μmol/L阿霉素誘導24 h后，斑馬魚活動能力受限，SV-BA距離增大，心房、心室較正常組明顯變大，出現不同程度的心包水腫，心率出現下降。實驗結果證實，10 μmol/L阿霉素能夠建立斑馬魚心臟損傷模型。每搏輸出量及心輸出量是衡量心臟功能強弱的重要指標，心輸出量的降低是心力衰竭的重要臨床指征[15]。本研究結果表明，40、80 μg/mL桔梗提取物干預24 h后，心臟損傷模型斑馬魚心包水腫消失，每搏輸出量及心輸出量均有所提高，心功能得到顯著改善，阿霉素誘導的心臟損傷得到了抑制。

綜上所述，桔梗提取物在保護阿霉素誘導的斑馬魚心臟損傷方面有一定的效果，但其具體分子機制以及信號通路還有待進一步研究。