李 芹，李 婷，賀 瑩，陳時(shí)洪*

(1.重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，重慶 400030；2.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

近年來，越來越多的人患有糖尿病，糖尿病已成為一個(gè)世界性的公共問題，是影響人類生活的重要疾病之一。糖尿病還能引起很多并發(fā)癥，如骨質(zhì)疏松、心血管疾病等[1-2]。測定血清中葡萄糖含量是診斷糖尿病的重要指標(biāo)之一。因此，簡單、快速和靈敏地測定葡萄糖在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中具有重要價(jià)值，對食品工業(yè)中質(zhì)量監(jiān)控和糖尿病病情監(jiān)控均有著重要意義[3-4]。目前檢測葡萄糖的方法很多，如化學(xué)發(fā)光法[5]、比色法[6]、熒光法[7]以及色譜法[8]等?；瘜W(xué)發(fā)光法對一系列化合物均有響應(yīng)，選擇性較差；比色法對被測物質(zhì)的純度要求較高，需要繁瑣的樣品預(yù)處理過程；熒光法局限于分析過程中需外加光源，因此不可避免地存在光散射的影響，從而影響檢測靈敏度；色譜法雖檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度高，但需要專門的儀器以及繁瑣的樣品前處理過程，成本高且費(fèi)時(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析儀(西瑞邁分析儀器有限公司)用于ECL檢測，高壓倍增管設(shè)置為600 V，低電位設(shè)置0 V，高電位為1.25 V；CHI760E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)用于循環(huán)伏安(CV)和電化學(xué)阻抗(EIS)掃描；JEM 1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)和Thermo escalab 250Xi X射線光電子能譜儀(美國熱電公司)用于材料的XPS表征；實(shí)驗(yàn)使用三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl或甘汞電極為參比電極。

葡萄糖氧化酶(GOx)、葡萄糖購自Sigma(St.Louis,Mo,USA),Ru(bpy)3Cl2購自蘇州鈉凱科技有限公司,三乙胺(Et3N)購于阿拉丁上海有限公司,三噻吩丙二酸(TA)、氯鉑酸(H2PtCl6)購于北京百靈威科技有限公司,以上試劑均為分析純；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)做測試底液；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 Pt NPs和 Pt NPs-Ru復(fù)合物的制備

Pt納米粒子(Pt NPs)的制備[10]:Pt NPs通過加熱H2PtCl6和TA的水溶液得到。首先將1.9 mL 0.02 mol/L H2PtCl6稀釋至50 mL，加入0.5 mL 0.3 mol/L TA后，所得溶液于100 ℃下攪拌20 min，即得到深棕色Pt NPs分散液。

Pt NPs-Ru復(fù)合物的合成[10]：在上述已制備好的Pt NPs分散液(5.0 mL)中，于劇烈攪拌下緩慢加入0.1 mL 0.04 mol/L Ru(bpy)3Cl2溶液。3 min后，出現(xiàn)大量黑色顆粒，在12 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀并用水洗滌，得到黑色的Pt NPs-Ru復(fù)合物，將其分散在2.0 mL水中備用。

圖1 Pt NPs-Ru復(fù)合物和傳感器的制備過程Fig.1 Preparation process of Pt NPs-Ru complex and sensor

1.3 傳感器的制備

玻碳電極(GCE，直徑4 mm)經(jīng)Al2O3粉末拋光后，用水和乙醇超聲清洗干凈。將處理好的電極置于室溫下晾干。移取10 μL Pt NPs-Ru復(fù)合物分散液滴涂于電極表面，室溫下靜置使其晾干。將15 μL 20 mg/L GOx 溶液滴涂至Pt NPs-Ru復(fù)合物修飾電極，4 ℃下孵育過夜，在水中浸洗，洗掉未被結(jié)合的酶，得到所需的ECL傳感器，制備過程如圖1所示。

1.4 檢測方法

使用三電極體系進(jìn)行檢測。光電倍增管電壓設(shè)為600 V，掃描電壓為0～1.25 V。檢測底液為含有10.0 mmol/L Et3N 的3.0 mL PBS溶液(pH 7.4，0.1 mol/L)。測定修飾電極對不同濃度葡萄糖的ECL響應(yīng)信號。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

利用透射電子顯微鏡(TEM)表征了Pt NPs-Ru復(fù)合物的微觀形貌(圖2A),可清晰觀察到復(fù)合物的顆粒結(jié)構(gòu)，由粒徑分布圖可知，其粒徑約1.1 nm(圖2A插圖)。進(jìn)一步采用X射線光電子能譜(XPS)對Pt NPs-Ru進(jìn)行表征，其元素組成情況示于圖2B。由圖可清楚地觀察到C1s峰、O1s峰、Pt4f峰以及Ru3p峰。圖2C、D分別顯示了Pt4f區(qū)在75.10 eV和71.85 eV處的2個(gè)結(jié)合能峰以及Ru3p區(qū)在464.70 eV處的特征峰。以上結(jié)果表明復(fù)合物同時(shí)存在Ru(Ⅱ)和Pt NPs，證明該復(fù)合物已制備成功。

2.2 電極修飾過程的CV、EIS與ECL表征

采用循環(huán)伏安法(CV)、電化學(xué)阻抗法(EIS)及電致化學(xué)發(fā)光法(ECL)分別對傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行表征。其中CV和EIS測試均在含有鐵氰化鉀(5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6])的PBS溶液中進(jìn)行。如圖3A所示，裸電極呈現(xiàn)出明顯的氧化還原峰(曲線a)。當(dāng)電極修飾上Pt NPs-Ru復(fù)合物時(shí)(曲線b)，由于Pt NPs上所帶的負(fù)電荷與[Fe(CN)6]3-/4-發(fā)生排斥而阻礙電子傳遞，導(dǎo)致峰電流明顯降低。當(dāng)電極進(jìn)一步修飾GOx后(曲線c)，峰電流進(jìn)一步降低，這是因?yàn)镚Ox同樣對電子傳遞具有阻礙作用。修飾電極過程的EIS表征圖則顯示，隨著Pt NPs-Ru復(fù)合物和GOx的修飾，其阻抗圖譜中的半圓直徑逐漸增大(圖3B)，表明阻抗值逐漸增大，表現(xiàn)出與CV相同的變化趨勢，進(jìn)一步表明傳感器已構(gòu)建成功。

為了進(jìn)一步證明傳感器的構(gòu)建過程，進(jìn)一步使用ECL進(jìn)行表征。ECL檢測在3.0 mL含有10.0 mmol/L Et3N的PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)中進(jìn)行。如圖3C所示，裸電極幾乎不能產(chǎn)生ECL信號(曲線a)，這是因?yàn)榇藭r(shí)電極不存在任何發(fā)光物質(zhì)。修飾Pt NPs-Ru納米復(fù)合物后的電極能產(chǎn)生很強(qiáng)的ECL信號(曲線b)。進(jìn)一步將GOx修飾至電極表面后，ECL強(qiáng)度有所減弱(曲線c)，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)大分子阻礙了電子傳遞，從而導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度降低。

(1)

(2)

(3)

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(5)

(6)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的影響研究了磷酸鹽緩沖溶液的pH值對體系ECL信號強(qiáng)度的影響。在含有10.0 mmol/L Et3N和1.0 μmol/L葡萄糖的PBS緩沖溶液(3.0 mL)中測試了傳感器的ECL信號隨不同pH值(5.0、6.0、7.4、8.0、9.0)的變化情況，結(jié)果如圖4A所示。由圖可知，pH值從5.0增至8.0時(shí)，ECL信號隨著pH值的增加而顯著增加。當(dāng)pH值由8.0變化至9.0時(shí)，ECL信號基本穩(wěn)定。這是由于共反應(yīng)試劑Et3N為堿性，在pH值5.0和6.0的酸性條件下Et3N被中和，故此時(shí)的ECL信號低?？紤]到酶催化效果，實(shí)驗(yàn)選用pH 7.4的PBS緩沖溶液作為檢測底液。

2.3.2 Pt NPs-Ru修飾量的影響進(jìn)一步探究了Pt NPs-Ru在電極上的修飾量對體系ECL信號的影響。在含有10.0 mmol/L Et3N的3.0 mL 0.10 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中測試了傳感器ECL信號隨Pt NPs-Ru在電極上修飾量(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 μL)的變化情況，結(jié)果示于圖4B。當(dāng)修飾量從5.0 μL增至10.0 μL時(shí)，ECL信號在不斷增加。當(dāng)修飾量為11.0 μL和12.0 μL時(shí)，ECL信號已超過檢測量程。為了確保檢測的準(zhǔn)確度，本實(shí)驗(yàn)選擇Pt NPs-Ru在電極上的修飾量為10 μL。

圖5 傳感器對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)Fig.5 ECL responses of the biosensor for different concentration of glucose glucose concentration(a-g):0.01,0.05,0.1,1.0,5.0,10, 50(×10-6 mol/L);pH 7.4 PBS,Et3N concentration： 10.0 mmol/L;insert：the calibration curve for glucose

2.4 傳感器的性能

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5顯示了傳感器對葡萄糖的響應(yīng)情況。當(dāng)葡萄糖濃度由1.0×10-8mol/L增至5.0×10-5mol/L時(shí)，傳感器的ECL信號不斷減小,線性曲線示于插圖B。由圖可知，在此范圍內(nèi)，ECL信號(I)與葡萄糖濃度的對數(shù)(lgc)之間有良好的線性關(guān)系，其線性方程為I=-1 575.51+(-1 285.98)lgc。相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 7,檢出限(S/N=3)為5.2×10-9mol/L。將該傳感器的性能與其它方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。相比于其他ECL方法，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的生物傳感器用于檢測葡萄糖具有更低的檢出限。

表1 不同生物傳感器檢測葡萄糖的比較Table 1 Comparison of different biosensors for the determination of glucose

2.4.2 穩(wěn)定性與選擇性穩(wěn)定性和選擇性是傳感器的重要性能。圖6A顯示了在含有10.0 mmol/L Et3N和5.0 μmol/L葡萄糖的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)底液中，目標(biāo)傳感器連續(xù)掃描10圈的ECL響應(yīng)情況。測得連續(xù)掃描10圈所得的ECL信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.88%，說明該生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性。選擇乳糖、蔗糖、麥芽糖和色氨酸作為潛在的干擾物質(zhì)，測試了傳感器在含有10.0 mmol/L Et3N的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)底液中,對0.05 μmol/L葡萄糖以及50.0 μmol/L上述干擾物質(zhì)的ECL響應(yīng)情況。如圖6B所示，與空白溶液相比，上述干擾物質(zhì)對所制備傳感器的ECL響應(yīng)無明顯影響，而在目標(biāo)物葡萄糖存在下，ECL響應(yīng)信號顯著減小，表明所構(gòu)建的生物傳感器擁有較好的選擇性。

3 結(jié) 論