劉紅艷，唐 琳，謝世偉，張文強(qiáng)，易忠勝，李 霞，單 楊,2

(1.桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅離子的多酚氧化酶蛋白，自發(fā)現(xiàn)以來在環(huán)境污染物的分解和治理過程中起著至關(guān)重要的作用[1-6]。甲酚是常見酚類化合物中的一種，包括鄰、間、對(duì)3種異構(gòu)體，被大量應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、香料、農(nóng)藥、染料等行業(yè)，是一種污染性強(qiáng)的工業(yè)原材料，可在生產(chǎn)及使用過程中釋放從而造成環(huán)境污染[7-9]。甲酚具有強(qiáng)烈的毒性和腐蝕性，對(duì)皮膚和粘膜有強(qiáng)烈刺激和腐蝕作用，吸入可引起各個(gè)器官受損，尤其對(duì)肝腎的毒害作用較大，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡[1,10-11]。此外，甲酚作為消毒劑的主要原料，除醫(yī)療消毒外，也被養(yǎng)殖業(yè)主用于牲畜出欄后的消毒殺菌，而這些消毒劑殘存在牲畜的糞便中，最后作為農(nóng)家肥的一部分又進(jìn)入到環(huán)境甚至人體中。雖然進(jìn)入環(huán)境中的甲酚一般濃度較低，甚至是微量的，但其進(jìn)入環(huán)境后極難降解，會(huì)通過食物鏈危害生物體和人類健康。由此可見，開展甲酚的降解研究對(duì)于環(huán)境污染控制及修復(fù)至關(guān)重要。Anna等通過將漆酶固定在螺旋膜反應(yīng)器上，對(duì)包含甲酚在內(nèi)的18種酚類底物進(jìn)行生物降解，得到漆酶對(duì)間甲酚、對(duì)甲酚和鄰甲酚的降解率均為40%左右[12]。Gonzalez-Coronel等將純化漆酶固定在3種載體上，選擇相對(duì)最好的漆酶固定系統(tǒng)降解間甲酚[13]。

本文以間甲酚為目標(biāo)化合物，通過計(jì)算模擬從理論角度預(yù)測了兩者之間的相互作用機(jī)制、結(jié)合信息等；選取3種同分異構(gòu)體的最佳計(jì)算結(jié)果，采用光譜法進(jìn)行定量和定性研究。通過兩種方法相互驗(yàn)證多角度分析了漆酶與甲酚的相互作用，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為研究環(huán)境中漆酶降解轉(zhuǎn)化甲酚污染物提供了理論和方法基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

漆酶(Laccase from Trametes versicolor，LAC，0.94 U/mg)，購自上海源葉生物有限公司。鄰甲酚(o-Cresol，OC)、間甲酚(m-Cresol，MC)、對(duì)甲酚(p-Cresol，PC)、冰醋酸、乙酸鈉等均為分析純試劑，購自汕頭西隴生化有限公司。

日立F-4600熒光光譜儀(日本株式會(huì)社日立制作所)；iS10傅立葉紅外光譜分析儀(Thermo Fisher公司)。

1.2 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

本研究采用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬，從分子水平上分析漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的相互作用。受體大分子漆酶(ID:1gyc)直接從PDB數(shù)據(jù)庫下載其PDB文件格式(htpp://www.rcsb.org/pdb)，下載完成后進(jìn)行水分子刪除、加氫并計(jì)算點(diǎn)電荷等處理[14-17];配體小分子甲酚通過ChemBioDraw Ultra軟件繪出并進(jìn)行幾何優(yōu)化；在分子對(duì)接過程中，為了能包括化合物所有原子，盒子尺寸設(shè)為122?× 106?× 114?，用Autogrid計(jì)算格點(diǎn)能量，對(duì)接運(yùn)算采用拉馬克遺傳算法，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

采用GROMACS 4.6 軟件對(duì)漆酶與甲酚體系進(jìn)行 20 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中模擬力場設(shè)定為GROMOS96 43A1，對(duì)漆酶與復(fù)合物進(jìn)行添加溶劑、建立水盒子、添加抗衡離子、能量最小化處理，建立平衡系統(tǒng)。

1.3 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

熒光試驗(yàn)均在熒光光譜儀上完成。在溫度298 K、掃描速度1 200 nm/min、電壓900 V及反應(yīng)時(shí)間2 s的條件下，分別測定漆酶與間甲酚混合物的熒光猝滅情況。在一系列10 mL比色管中，分別加入2 mL漆酶儲(chǔ)備液(最終濃度為1.0× 10-4mol/L)和不同體積(10～90 μL)的間甲酚(1.0×10-5mol/L)儲(chǔ)備液，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容。于290、300 K兩個(gè)溫度下恒溫反應(yīng)5 min，以280 nm 為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射熒光狹縫寬度均設(shè)為2.5 nm，測定體系在300～450 nm 波長范圍的熒光光譜。

1.4 紅外光譜

依次掃描0.01 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液、0.1 mmol/L游離的漆酶溶液、0.1 mmol/L游離的間甲酚溶液、漆酶與間甲酚混合物溶液(物質(zhì)的量之比1∶1)4個(gè)樣品。

游離漆酶光譜通過漆酶在緩沖液中的光譜減去緩沖液的光譜得到，漆酶-間甲酚光譜等于漆酶與間甲酚混合物的光譜減去游離間甲酚的光譜。

在傅立葉反卷積后，通過二階導(dǎo)數(shù)擬合曲線，計(jì)算特征峰面積以得到每個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的分子對(duì)接

經(jīng)Autodock 4.2軟件分別得漆酶與鄰甲酚(Laccase-o-cresol，LAC-OC)、間甲酚(Laccase-m-cresol，LAC-MC)及對(duì)甲酚(Laccase-p-cresol，LAC-PC)的最優(yōu)對(duì)接結(jié)果(表1)。

表1 漆酶與甲酚同分異構(gòu)體對(duì)接信息Table 1 Docking information of laccase and cresol isomers

從表中可以看出，漆酶與3種甲酚結(jié)合能相差不大，其中間甲酚相較于其他兩個(gè)甲酚異構(gòu)體結(jié)合能最小，說明在3種同分異構(gòu)體中漆酶與間甲酚更容易結(jié)合;通過比較抑制常數(shù)可知，漆酶與間甲酚的結(jié)合相對(duì)來說最穩(wěn)定。漆酶與鄰甲酚、對(duì)甲酚的結(jié)合略有差異，但與對(duì)甲酚結(jié)合更穩(wěn)定，以上結(jié)果說明漆酶能與甲酚反應(yīng)形成復(fù)合物。

圖1顯示了漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的結(jié)合特征信息。從圖1中可以看出，漆酶與鄰甲酚和間甲酚的結(jié)合位點(diǎn)相似且都被Phe69、Phe68、Gln70、Ala71、Gln102、His98等殘基包圍。此外，從蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)合位點(diǎn)圖(中間位置的圖)可以看出，鄰甲酚和間甲酚基本鑲嵌在蛋白內(nèi)部，而對(duì)甲酚只是依附在蛋白表面。

圖1 漆酶與甲酚同分異構(gòu)體結(jié)合特征信息圖Fig.1 Binding characteristics of laccase and cresol isomers from left to right:binding site diagram based on protein skeleton,binding site map based on the surface of protein molecular,the detail drawing of binding site(從左至右:基于蛋白質(zhì)骨架的結(jié)合部位圖，基于蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)合位點(diǎn)圖，結(jié)合部位局部詳圖)

2.2 漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的相互作用力

將分子對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入Ligplot+軟件分析漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的氫鍵和疏水作用。漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的相互作用如圖2所示。由圖可知，漆酶與鄰甲酚和間甲酚分別形成兩個(gè)氫鍵，而與對(duì)甲酚形成4個(gè)氫鍵，氫鍵鍵長如圖所示。此外，漆酶氨基酸殘基均是與甲酚上的羥基形成氫鍵。這一結(jié)果表明氫鍵對(duì)漆酶與甲酚復(fù)合物的形成起重要作用。另外，鄰甲酚、間甲酚與漆酶形成的復(fù)合物中，甲酚被蛋白質(zhì)氨基酸殘基形成的疏水性“半包裹”界面包圍，其中漆酶與鄰甲酚形成疏水作用的主要氨基酸殘基分別為Pro100、Val99、Phe68、Phe97、Gln70、Ala71、Thr73、Phe69、His98，與間甲酚形成疏水作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為Pro100、Phe68、Gln70、Ala71、Thr73、Asp101、His98。然而漆酶中與對(duì)甲酚發(fā)生疏水作用的氨基酸殘基和前兩者有很大不同，它們分別為Leu459、Phe344、Phe450和Pro79。這主要是由甲酚與漆酶的對(duì)接位點(diǎn)不盡相同造成的。綜上所述，氫鍵和疏水作用是漆酶與甲酚形成復(fù)合物的主要作用力，但因結(jié)構(gòu)差異，所形成的氫鍵數(shù)目及參與疏水作用的氨基酸殘基略有不同。

圖2 漆酶與甲酚同分異構(gòu)體相互作用力圖Fig.2 Interaction between laccase and cresol isomers

2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬(Molecular dynamics simulation，MD)可以進(jìn)一步找出模擬環(huán)境條件下漆酶-甲酚復(fù)合物的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)行為。為了探索MD模擬過程中漆酶的構(gòu)象穩(wěn)定性和進(jìn)行有效的構(gòu)象采樣，本文基于起始結(jié)構(gòu)計(jì)算了均方根偏差(Root mean squared deviation，RMSD)，將模擬后的結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，RMSD值越小，模擬的系統(tǒng)越穩(wěn)定。從圖3A可以看出，曲線在8 ns左右趨于水平，說明該時(shí)間下無論漆酶蛋白還是漆酶-甲酚復(fù)合物體系都達(dá)到了平衡。

回旋半徑Rg代表蛋白的緊密度，Rg值越高，表示蛋白質(zhì)特定區(qū)域的結(jié)構(gòu)越松散。很顯然，在圖3B中Rg值的大小順序是LAC-OC > LAC > LAC-PC > LAC-MC，說明漆酶與間甲酚結(jié)合后蛋白結(jié)構(gòu)更緊密、更穩(wěn)定，而漆酶與鄰甲酚結(jié)合后蛋白構(gòu)象比初始狀態(tài)松散，這與分子對(duì)接及RMSD圖所得結(jié)果相同。

均方根波動(dòng)(Root mean square fluctuation，RMSF)是基于時(shí)間對(duì)所有殘基進(jìn)行靈活性的平均。觀察圖3C可知，漆酶殘基在60～100這個(gè)區(qū)域內(nèi)波動(dòng)較明顯，說明漆酶與甲酚極有可能在這一區(qū)域發(fā)生作用。綜上所述，漆酶與甲酚同分異構(gòu)體大致在殘基60～100區(qū)域結(jié)合且漆酶與間甲酚結(jié)合最穩(wěn)定，對(duì)甲酚次之，鄰甲酚相對(duì)較差。這一結(jié)果與分子對(duì)接所得結(jié)果完全一致。

2.4 間甲酚與漆酶的熒光猝滅機(jī)制

由分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果，選取結(jié)果最佳的間甲酚作為研究對(duì)象。生物大分子會(huì)產(chǎn)生熒光主要是由于其包含3種熒光團(tuán)，即色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)殘基。且計(jì)算機(jī)模擬分析中發(fā)現(xiàn)，漆酶與間甲酚結(jié)合時(shí)的主要氨基酸殘基為Phe，因此本研究通過熒光試驗(yàn)檢測漆酶與間甲酚結(jié)合前后熒光強(qiáng)度是否發(fā)生改變，并通過熒光信號(hào)的變化鑒定配體-蛋白質(zhì)之間的相互作用。由于290、300 K兩個(gè)溫度下，間甲酚對(duì)漆酶的熒光猝滅趨勢相同，故只列出了290 K時(shí)的熒光猝滅譜圖(圖4A)。由圖可知，在芳香族殘基激發(fā)波長280 nm的作用下，漆酶在發(fā)射波長344 nm左右有很強(qiáng)的固有熒光。隨著間甲酚濃度增加，漆酶熒光強(qiáng)度不斷下降。熒光猝滅現(xiàn)象表明間甲酚能夠與漆酶發(fā)生相互作用。

蛋白質(zhì)的熒光猝滅過程因機(jī)理的不同主要分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。熒光強(qiáng)度隨配體濃度增加而降低的物理現(xiàn)象，可歸因于蛋白質(zhì)與配體之間的碰撞導(dǎo)致的動(dòng)態(tài)猝滅，或是形成了非熒光復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。可使用穩(wěn)態(tài)熒光設(shè)備和改變樣品的溫度來區(qū)分兩種機(jī)理。本文通過改變溫度的方法來判斷機(jī)理并利用Stem-Volmer 方程[18-22]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析:

IF0/IF=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中，IF0和IF分別表示加入猝滅劑前后漆酶的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)；τ0是無猝滅劑時(shí)生物大分子的內(nèi)源性熒光壽命，約10-8s；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；[Q]為間甲酚的濃度。以IF0/IF對(duì)[Q]作290 K和300 K兩個(gè)溫度下的Stern-Volmer 曲線圖(圖4B)，并由Stern-Volmer 方程求出各個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)(R2，表2)。

圖4B為不同濃度的間甲酚與漆酶相互作用的Stern-Volmer曲線。通常，在動(dòng)態(tài)猝滅中，猝滅劑和熒光之間發(fā)生分子間碰撞，最終導(dǎo)致KSV隨著溫度的升高而增加。在靜態(tài)猝滅中，漆酶與間甲酚之間通過弱相互作用形成基態(tài)復(fù)合物，溫度升高則可能會(huì)降低復(fù)合物穩(wěn)定性，從而降低KSV[14]。根據(jù)漆酶熒光猝滅滴定數(shù)據(jù)計(jì)算的KSV值見表2。由表2可知，隨著溫度的升高，KSV值降低，表明漆酶熒光主要通過靜態(tài)機(jī)制被間甲酚猝滅，且是由于形成漆酶-間甲酚復(fù)合物而引起的。此外，漆酶與間甲酚之間的猝滅常數(shù)Kq的數(shù)量級(jí)為1014，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)大分子的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，進(jìn)一步證明了漆酶的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅[18-19]。

表2 不同溫度下間甲酚對(duì)漆酶的熒光猝滅常數(shù)Table 2 Fluorescence quenching constants of laccase by m-cresol at different temperatures

2.5 傅立葉變換紅外光譜

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可以使用傅立葉紅外變換光譜來估算。從圖5A可以觀察到，游離漆酶的特征性酰胺Ⅱ和Ⅰ吸收峰在1 153 cm-1和1 646 cm-1處，漆酶與間甲酚結(jié)合后峰位置移至1 170 cm-1和1 639 cm-1且峰強(qiáng)度變小。由于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中酰胺Ⅰ帶最敏感，所以常用該范圍的光譜變化來分析不同二級(jí)結(jié)構(gòu)含量[23]。酰胺Ⅰ吸收峰位置的移動(dòng)及峰強(qiáng)度的變化表明，漆酶與間甲酚結(jié)合，導(dǎo)致漆酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

借助酰胺Ⅰ帶的擬合曲線進(jìn)一步對(duì)游離漆酶和漆酶-間甲酚復(fù)合物蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析[24]。酰胺Ⅰ帶中，1 610～1 637 cm-1、1 638～1 648 cm-1、1 649～1 660 cm-1、1 661～1 680 cm-1、1 681～1 692 cm-1分別為β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-反向平行結(jié)構(gòu)。由圖5B的擬合結(jié)果可知，游離的漆酶由1.14%的β-折疊、7.45%的無規(guī)則卷曲、23.20%的α-螺旋、40.23%的β-轉(zhuǎn)角和27.98%的β-反向平行結(jié)構(gòu)組成。與間甲酚結(jié)合后，漆酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。β-折疊、無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量分別增加至13.56%、31.36%和31.16%；而β-轉(zhuǎn)角和β-反向平行結(jié)構(gòu)分別降至21.53%和2.39%，由此可知，漆酶與間甲酚結(jié)合后，漆酶內(nèi)部的β-轉(zhuǎn)角和β-反向平行向β-折疊、無規(guī)則卷曲和α-螺旋轉(zhuǎn)化。綜上，漆酶與間甲酚結(jié)合后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，該結(jié)果驗(yàn)證了分子動(dòng)力模擬的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究通過分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬探究了漆酶與甲酚同分異構(gòu)體的相互作用，分子對(duì)接結(jié)果表明，漆酶與間甲酚更容易結(jié)合，生成的復(fù)合物更加穩(wěn)定。此外，通過光譜分析方法研究了漆酶與間甲酚的猝滅機(jī)制。穩(wěn)態(tài)熒光表明漆酶與間甲酚能夠發(fā)生相互作用，猝滅常數(shù)隨溫度的變化情況證明了漆酶熒光主要通過靜態(tài)機(jī)制被間甲酚猝滅。酰胺Ⅰ帶的紅外光譜揭示了漆酶與間甲酚相互作用后漆酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，其中β-折疊、無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量增加，β-轉(zhuǎn)角和β-反向平行結(jié)構(gòu)的含量減少。計(jì)算模擬與光譜方法所得結(jié)果一致。本研究可為漆酶催化降解甲酚提供理論基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)信息。