一株產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915的選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

耿靜 韓秋霞 高文靜 肖麗嬌

摘要： 以1株篩選自鹽濃度為21%海鹽水的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915為研究對(duì)象，該菌株可產(chǎn)胞外蛋白酶。以Gibbons培養(yǎng)基為基底，采用單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)影響嗜鹽菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要培養(yǎng)基成分和工藝條件進(jìn)行篩選，確定主要影響因子及其取值范圍;并在此基礎(chǔ)上，通過Design-Expert軟件對(duì)主要影響因子進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蛋白酶活性為響應(yīng)值優(yōu)化菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件，并驗(yàn)證響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的一致性。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)條件如下：以Gibbons培養(yǎng)基為基底，NaCl濃度為5%，pH值為8，培養(yǎng)溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%，蛋白胨的含量為1.17%，KCl的含量為1.0‰，檸檬酸鈉的含量為5‰，經(jīng)響應(yīng)面分析得到的蛋白酶活性為44.09 U，與預(yù)期值44.22 U相比，差異為0.299%。結(jié)果豐富了嗜鹽蛋白酶的研究和開發(fā)依據(jù)，為高鹽環(huán)境下食品工業(yè)催化和農(nóng)業(yè)制劑催化提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 嗜鹽蛋白酶;單因素試驗(yàn);響應(yīng)面法;最陡爬坡試驗(yàn);影響因子

中圖分類號(hào)： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0287-08

嗜鹽菌通常是指在高鹽環(huán)境中可以進(jìn)行正常生長(zhǎng)和生理代謝的微生物[1-2]。在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)的嗜鹽微生物能夠利用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝活動(dòng)，并能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等胞外水解酶，這些酶被稱為嗜鹽水解酶，能夠在高鹽環(huán)境下催化完成許多水解反應(yīng)[1-3]。除此之外，許多嗜鹽水解酶熱穩(wěn)定性非常好，且能適應(yīng)廣泛的pH值環(huán)境。由于具有這些獨(dú)特的性質(zhì)，嗜鹽水解酶在不利的條件下對(duì)生物技術(shù)應(yīng)用具有吸引力[4-7]。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件是提高蛋白酶產(chǎn)量的重要途徑之一，也是開發(fā)低成本發(fā)酵工藝的重要步驟之一[8-10]。響應(yīng)面分析法（RSM）是酶工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)基優(yōu)化和工藝優(yōu)化的有效工具。在優(yōu)化之前篩選重要參數(shù)非常重要，其目的是忽略次要參數(shù)，減少試驗(yàn)次數(shù)，以方便試驗(yàn)的進(jìn)行，其中單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)相結(jié)合的方法是最為常用的研究手段[10-13]。本研究以1株篩選自21%海鹽水的可產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)相結(jié)合的方法分析菌株產(chǎn)蛋白酶的主要影響因素，確定各因素最佳濃度，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)而得到菌株產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)基成分和工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌株樣品來源

采集山東省昌邑市某鹽場(chǎng)濃度為21%海鹽水水平面下15 cm處的水樣，4 ℃暫存。帶回后稀釋水樣并涂布，分離純化后，得到中度嗜鹽菌MK070915，斜面保藏于冰箱中。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑

干酪素，購(gòu)自北京Solatrio有限公司;福林酚試劑，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸，購(gòu)自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;碳酸鈉購(gòu)自天津市巴斯夫化工貿(mào)易有限公司;L-酪氨酸，購(gòu)自天津迪博化工有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基

液體Gibbons培養(yǎng)基（GM）：酪素水解物5 g，酵母浸出物10 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鈉 3 g，MgSO4·7H2O 20 g，KCl 2 g，NaCl 100 g，蒸餾水1 000 mL。固體GM：在液體GM的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂。滅菌條件：121 ℃，20 min。

篩選培養(yǎng)基：在固體GM的基礎(chǔ)上添加1%脫脂奶粉。滅菌條件：115 ℃，10 min。

1.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

1.3.1 菌株的初篩

將純化后的菌株點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃下倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明水解圈。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

1.3.2.1 粗酶液的制備

將純化后的菌株按2%（質(zhì)量/體積）的比例接種至液體GM中，在 37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)72 h后，將菌液在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，即粗酶液，備用。

1.3.2.2 菌株的復(fù)篩

制作牛奶-鹽-瓊脂固體平板并放置牛津小杯，作標(biāo)記;以空白GM作對(duì)照，未離心的菌液作為試驗(yàn)組1，粗酶液作為試驗(yàn)組2，分別加入到牛津小杯中，于37 ℃培養(yǎng)箱中放置 12 h，觀察透明圈生成情況。

牛奶-鹽-瓊脂固體培養(yǎng)基：脫脂牛奶25 g，NaCl 25 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂添加量2%。

1.4 福林酚法測(cè)定蛋白酶活性

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》，采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性。

酶活性定義：將在溫度為40 ℃、pH值為7.0的條件下，1 mL粗酶液1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為1個(gè)酶活性單位，用U來表示。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)活化后的菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，并采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[2]。

1.6 菌株生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用

1.6.1 菌株生長(zhǎng)條件

將液體GM的NaCl濃度分別設(shè)置為0、5%、10%、15%、20%、25%，pH值分別設(shè)置為5、6、7、8、9、10;將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為10、15、20、25、30、35、40 ℃;向液體GM中分別添加金屬離子Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+，使各金屬離子終濃度為5 mmol/L。將活化后的菌株按2%（質(zhì)量/體積）的比例接種至上述培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 下振蕩培養(yǎng)72 h;每隔4 h取樣1次，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶活性。

1.6.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用

以酵母浸出物（對(duì)照）葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為唯一碳源添加到液體GM中;以蛋白胨（對(duì)照）、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、酪素水解物、氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸銨為唯一氮源添加到液體GM中，將活化后的菌株按2%（質(zhì)量/體積）的比例分別接種至上述培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)72 h，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶活性。

1.7 單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)培養(yǎng)基的各組成部分進(jìn)行產(chǎn)酶單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置4個(gè)因素的最陡爬坡試驗(yàn)，按照不同因素、不同水平配制培養(yǎng)基，將活化后的菌株按2%（質(zhì)量/體積）的比例接種于上述培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)72 h，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶活性。單因素試驗(yàn)設(shè)置如下：碳源濃度梯度為0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%;氮源濃度梯度為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%;KCl添加終濃度分別為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰;檸檬酸鈉添加終濃度分別為1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰。

1.8 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以及Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，4個(gè)因素分別以A（麥芽糖）、B（蛋白胨）、C（KCl）和D（檸檬酸鈉）表示，以單因素試驗(yàn)結(jié)果的最佳條件作為中水平，即0水平，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平見表1。

1.9 數(shù)據(jù)處理

生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶特性試驗(yàn)分別設(shè)置3組平行樣品，按照時(shí)間間隔分別取樣測(cè)定蛋白酶活性，取平均值，并繪制生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶特性曲線。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)以及最陡爬坡試驗(yàn)均測(cè)定3次，用SPSS 18.0軟件為測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，并根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果對(duì)優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

如圖1所示，菌株MK070915在初篩平板上產(chǎn)生透明水解圈，說明其具有產(chǎn)蛋白酶的能力。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將通過生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序得到的16S rDNA序列提交到GenBank中進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。MK070915菌株與Salinivibrio屬內(nèi)Salinivibrio costicola 18 AG的同源性為91%，說明它們?yōu)橥N微生物，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，確定該菌株為Salinivibrio屬成員，因此將其命名為Salinivibrio sp. MK070915。

2.3 福林酚法測(cè)定蛋白酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性，以標(biāo)準(zhǔn)品 L-酪氨酸濃度（x）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)濃度的吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制蛋白酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。曲線方程為y=0.011 0x+0.033 3，r2=0.999 5，可信度較高，可用。而蛋白酶活性的計(jì)算公式為

x=D×K×n×4/10。

式中：x為樣品的蛋白酶活性，U/g或U/mL;D為平行試驗(yàn)中樣品的平均吸光度;K為吸光常數(shù);n為稀釋倍數(shù)。帶入方程可得，K=84.374。

2.4 菌株生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用

經(jīng)3次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MK070915菌株均不能生長(zhǎng)于NaCl濃度為0%、20%、25%以及pH值為5和10的條件下，因此本研究不再對(duì)這些處理進(jìn)行分析。如圖4-A所示，菌株可以在NaCl濃度為5%～15%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并產(chǎn)生蛋白酶，當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)，該菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力最大，因此，判斷該菌株為中度嗜鹽菌，并選擇5%的NaCl濃度進(jìn)行下一步生長(zhǎng)條件探索。如圖4-B所示，培養(yǎng)基pH值在6～9之間時(shí)，菌株均可以生長(zhǎng)并產(chǎn)生蛋白酶;當(dāng)pH值為5和10時(shí)，菌株無法生長(zhǎng);當(dāng)pH值為8時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力高于其他pH值條件，因此選擇8為該菌株產(chǎn)酶的最適pH值。如圖4-C所示，菌株在10～40 ℃條件下可以進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)生蛋白酶，溫度適應(yīng)范圍較廣;當(dāng)培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí)，該菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng);當(dāng)培養(yǎng)溫度在15～25 ℃之間時(shí)，溫度對(duì)該菌株產(chǎn)酶能力的促進(jìn)作用比較明顯。如圖4-D所示，F(xiàn)e3+、Ni2+、Cu2+、Mn2+的添加對(duì)菌株后期的產(chǎn)酶能力具有促進(jìn)作用，但是對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下的菌株產(chǎn)酶開始的時(shí)間為36 h左右，說明上述金屬離子的存在對(duì)于菌株前期的產(chǎn)酶活性具有一定的抑制作用，Zn2+的存在使得菌株無法正常生長(zhǎng)，其他金屬離子的存在不影響菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，但是對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下的菌株產(chǎn)酶能力相較于未添加金屬離子的原液差。

菌株Salinivibrio sp. MK070915可以利用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為碳源和氮源，這與已報(bào)道的嗜鹽菌產(chǎn)蛋白酶的特點(diǎn)[15]相吻合。如圖5-A所示，碳源為麥芽糖時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活性比原培養(yǎng)基中以酵母浸出物為碳源時(shí)增加了1.74倍;如圖5-B所示，氮源為蛋白胨時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶表現(xiàn)出來的活性最高，而其他氮源的添加并沒有明顯地提高菌株產(chǎn)蛋白酶的能力，當(dāng)將酪素水解物和亞硝酸鈉作為唯一氮源添加到培養(yǎng)基中時(shí)，甚至抑制了菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。因此選用麥芽糖作為碳源替代GM中的酵母浸出物，氮源物質(zhì)仍為原培養(yǎng)基中的蛋白胨。

2.5 單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)

針對(duì)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶影響最大的4個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，分別于各個(gè)因素各水平條件下接種活化后的菌株，在37 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h后測(cè)定粗酶液蛋白酶活性。如圖6所示，麥芽糖添加量為 1.5% 時(shí)，蛋白酶活性達(dá)到最大值，添加量超過2.5%時(shí)，蛋白酶活性急劇下降;蛋白胨作為最優(yōu)氮源，最佳添加量為1.0%;KCl的最佳添加量為2.0‰，而檸檬酸鈉的最佳添加量為4‰。然而最優(yōu)發(fā)酵條件并不一定是各個(gè)單因素所得最佳條件的簡(jiǎn)單組合，需要在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)來確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)各因素水平的選擇如下：麥芽糖添加量為1.25%～1.75%，蛋白胨添加量為 0.75%～1.25%，KCl添加量為1.0‰～3.0‰，檸檬酸鈉添加量為3‰～5‰;將蛋白酶活性作為響應(yīng)值。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶條件

以麥芽糖（A）、蛋白胨（B）、KCl（C）和檸檬酸鈉（D）為試驗(yàn)因素，蛋白酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照二次項(xiàng)回歸方程進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面軟件處理后確定回歸方程為蛋白酶活性=37.22-2.91A+2.52B-3.93C+0.40D+2.72AB-5.97AC-2.27AD+2.24BC+0.75BD-3.44CD-1.86A2-2.20B2-2.08C2+0.70D2。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建的回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，本試驗(yàn)所得模型P值為0.000 4，說明模型極顯著（P<0.01）;模型失擬項(xiàng)的P值為0.382 7，說明模型失擬項(xiàng)不顯著。一次項(xiàng)A、B、C對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響極顯著（P<0.01）;二次項(xiàng)B2、C2對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響顯著（P<0.05）。兩因子試驗(yàn)，麥芽糖和KCl、KCl與檸檬酸鈉之間交互作用對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響極顯著（P<0.01）;麥芽糖與蛋白胨之間的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響顯著（P<0.05）。

以蛋白酶的活性為響應(yīng)值，采用軟件作響應(yīng)曲面圖。如圖7-A所示，曲面圖形的頂點(diǎn)落在中心位置左右，區(qū)域俯視圖趨近于橢圓形，說明麥芽糖和蛋白胨的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響顯著;麥芽糖和KCl交互作用的響應(yīng)曲面如圖7-B所示，檸檬酸鈉和KCl交互作用的相應(yīng)曲面如 圖7-F所示，2個(gè)曲面圖形的頂點(diǎn)落在中心位置，說明它們之間的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響較為顯著;麥芽糖和檸檬酸鈉交互作用的響應(yīng)曲面如圖7-C所示，蛋白胨和檸檬酸鈉交互作用的響應(yīng)曲面如圖7-E所示，2個(gè)曲面圖形的曲線比較平穩(wěn)，區(qū)域俯視圖趨近于橢圓形，說明它們之間的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響不顯著;蛋白胨和KCl交互作用的響應(yīng)曲面如圖7-D所示，曲面圖形的曲線較陡，區(qū)域俯視圖形也趨近于橢圓形，然而，橢圓形區(qū)域并無實(shí)線，說明它們之間的交互作用并沒有體現(xiàn)在此模型中。

通過Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最優(yōu)培養(yǎng)條件如下：以Gibbons培養(yǎng)基為基底，添加5% NaCl，調(diào)整pH值為8，設(shè)置培養(yǎng)溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%，氮源為蛋白胨，含量為1.17%，添加1.0‰ KCl、5‰檸檬酸鈉。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)方案對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，以此檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可行性，經(jīng)過3次重復(fù)性試驗(yàn)，最終得到的蛋白酶活性可達(dá) 44.09 U，與預(yù)期值44.22 U相比，差異為0.294%，表明該模型合理可靠， 所優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件能夠被用于蛋白酶的高效產(chǎn)酶培養(yǎng)。

3 討論與結(jié)論

從鹽濃度為21%的曬鹽場(chǎng)海鹽水中分離得到1株Salinivibrio屬的中度嗜鹽菌MK070915，該菌株在適宜培養(yǎng)條件下可產(chǎn)胞外蛋白酶。

采用固體Gibbons培養(yǎng)基，對(duì)該菌株進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行菌株產(chǎn)蛋白酶的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生較大的透明水解圈，說明它具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力;通過進(jìn)一步對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，該菌株可以在NaCl濃度為5%～10%、pH值為6～9、溫度為 10～40 ℃的條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)蛋白酶，且可以利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為碳源，利用蛋白胨、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白、氯化銨和硝酸銨為氮源。利用單因素試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的最適培養(yǎng)條件：以Gibbons培養(yǎng)基為基底，添加5% NaCl，調(diào)整pH值為8，設(shè)置培養(yǎng)溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%;氮源為蛋白胨，含量為 1.17%，KCl含量為1.0‰，檸檬酸鈉含量為5‰。經(jīng)響應(yīng)面分析得到的蛋白酶活性為44.09 U，而預(yù)期值為44.22 U，二者之間的差異為0.294%。

本研究中的可產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌菌株Salinivibrio sp. MK070915經(jīng)過優(yōu)化之后，其蛋白酶活性明顯提高，與2007年報(bào)道的菌株Salinivibrio sp. AF-2004所產(chǎn)蛋白酶[15]相比，酶活性提高尤為明顯;其中溫度對(duì)蛋白酶活性的影響較大，20 ℃作為發(fā)酵溫度，可以有效的節(jié)能減排。

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收 稿日期：2018-12-24

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2014EMM005）。

作者簡(jiǎn)介：耿 靜（1993—），女，山東淄博人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭塞}微生物產(chǎn)酶。E-mail：15764230941@163.com。