抗肝纖維化佤族用藥篩選研究

梁志慶 倪凱 李文琦

摘要：目的 研究佤族肝病用藥針對肝星狀細胞HSC-T6增值和活力的影響從而篩選出有效的抗肝纖維化藥物。方法 采用Celigo Cytomter全視野細胞掃描分析儀，直接對健康生長條件下空白組及分別以不同濃度給予等量不同藥的給藥組肝星狀細胞進行分析，通過對細胞增值和活力的觀察分析，篩選出具有顯著抑制肝星狀細胞增值的藥材。結果 給藥組肝星狀細胞HSC-T6的細胞數(shù)目少于空白組肝星狀細胞HSC-T6的細胞數(shù)目。結論 佤族肝病用藥對肝星狀細胞有一定的抑制作用。

關鍵詞：佤藥;肝纖維化;肝星狀細胞;篩選

中圖分類號：R29 ? 文獻標志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2020）02-0087-03

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程和發(fā)展途徑，是肝臟對各種損傷所產(chǎn)生的一種修復反應，其主要特征表現(xiàn)為肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSC）的大量增殖和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積特別是膠原的過度合成。在肝纖維化的早期，肝星狀細胞由“靜止”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎罨钡募〕衫w維細胞（myofibroblast，MFB），隨后活化的肝星狀細胞過度增殖并大量合成各種細胞外基質(zhì)成分[1-2]。肝星狀細胞（HSC）是肝纖維化的細胞學基礎，是肝纖維化的效應細胞，也是細胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細胞，其活化是肝纖維化形成的開端[3-4]。因此，臨床主要通過抑制HSC活化和促進HSC凋亡來逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程。在前期調(diào)研過程中，課題組發(fā)現(xiàn)佤族藥治療肝病具有本民族的特色和優(yōu)勢，近些年已在單味中藥、單驗方等方面取得了一定的進展。在佤族地區(qū)，民間佤醫(yī)非常注重鮮品藥物（以植物藥為主）的使用，在使用鮮品藥物中常用的劑型有湯劑、飲劑、外包劑、外搽劑、外洗劑等。肝炎則多用日不給杏、努公把、日不潤卜歪、日不安里。德娘百艾（均為佤名）等[5-7]。

課題組在實驗過程中正是選擇了20余種佤族治療肝病的習用藥材，進一步在肝星狀細胞HSC-T6上進行驗證分析，通過Celigo Cytomter全視野細胞掃描分析儀對健康生長條件下的肝星狀細胞以及給藥之后的不同時間段的肝星狀細胞狀態(tài)進行觀察分析總結，得出最后結論。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 肝星狀細胞HSC-T6細胞株購自于中國科學院昆明動物研究所細胞庫（編號：KCB200703YJ）。

1.2 實驗藥物與試劑 實驗用佤藥共26種，隨機數(shù)字編號為1到26號，批號：20190505，均購自于滄源縣中醫(yī)佤醫(yī)醫(yī)院;中美特級胎牛血清（1829596）、DMEM/高糖培養(yǎng)液（0010219）、青霉素-鏈霉素溶液（1843964）、胰蛋白酶溶液（00034618）上述試劑均購自云南澤浩商貿(mào)有限公司。

1.3 實驗儀器 Celigo Cytomter全視野細胞掃描分析儀，美國Nexcelom，耐細隆生物儀器（上海）有限公司;真空操作臺，AIRTECH;OLYMPUS BX600顯微鏡，奧林巴斯（北京）銷售服務有限公司;CO2細胞培養(yǎng)箱，美國SHELLAB;DLAB離心機，型號：DM0412，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司;超純水系統(tǒng)，英國ELGA Classic UF;-80℃超低溫冰箱，Ermo Fisher;TGL16M冷凍高速離心機 Eppendow。

1.4 藥材前處理 隨機抽選編號5，8，10，23，24共5種藥材每種各100g，按1：10的比例加水，煎煮30分鐘，濾出藥液。取藥渣再按上述方法提取兩次，合并三次濾液，濃縮濾液至20ml，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。最后藥物濃度? g/mL的原液，在80℃水浴30分鐘、連續(xù)3天高溫滅活后，1000 rpm離心10分鐘，-20℃凍存?zhèn)溆?。實驗時臨用時用DMEM培養(yǎng)基溶解藥物為20 mmol/L母液濃度后，倍比稀釋至3 個濃度（200、400、800 μg/mL）三組備用。

1.5 受試藥材對HSC-T6細胞增殖和細胞活力的影響 將HSC-T6細胞消化傳代，取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，將每組細胞以1×104個/孔接種于96孔板中。然后放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后分別加入等量受試藥材，每種藥材分別設3個濃度組（200、400、800 μg/mL），用培養(yǎng)基稀釋至相應濃度，每組設4個復孔，空白組加入等量培養(yǎng)基，分別在藥材刺激后24 h，48 h，72 h取出96孔板，用Celigo Cytomter全視野細胞掃描分析儀檢測細胞增值和細胞活力情況，從而評價藥物對HSC-T6細胞生長的影響，篩選出對其增殖具有顯著抑制作用的藥材。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗結果用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計，各組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布、方差齊用方差分析，方差不齊用非參數(shù)檢驗，P>0.05為差異無顯著性意義，P<0.01為差異有非常顯著性意義，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 不同濃度的5號佤藥對平均細胞數(shù)的影響 從實驗結果看，佤藥A中、高濃度對肝星狀細胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細胞數(shù)呈緩慢增長趨勢，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 不同濃度的8號佤藥對平均細胞數(shù)的影響 從實驗結果看，佤藥B中、高濃度對肝星狀細胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細胞數(shù)呈緩慢增長趨勢，與空白組比較，高中濃度組在0～72 h時，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 不同濃度的10號佤藥對平均細胞數(shù)的影響 從實驗結果看，佤藥C各劑量濃度對肝星狀細胞數(shù)均無有影響，肝星狀細胞數(shù)呈增長趨勢，與空白組比較，各劑量組差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 不同濃度的佤藥23號對平均細胞數(shù)的影響 從實驗結果看，佤藥D中、高濃度對肝星狀細胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細胞數(shù)呈緩慢增長趨勢，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

2.5 不同濃度的佤藥24號對平均細胞數(shù)的影響 從實驗結果看，佤藥E中、高濃度對肝星狀細胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細胞數(shù)呈緩慢增長趨勢，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

3 討論

通過調(diào)研搜集了20余種佤藥，均為當?shù)刎翎t(yī)常用的肝病用藥，進一步查閱文獻，隨機抽選5種藥材進行細胞實驗的初篩，下一步擬擴大篩選范圍，以期發(fā)掘更多治療肝病有效的佤藥。5號藥的功效為清熱解毒，利水消腫，佤族地區(qū)常用于治療急性黃疸型肝炎;8號藥的功效為益氣健脾，清熱安神，佤族地區(qū)常用于治療病毒性肝炎;10號藥的功效為祛風除濕，續(xù)筋接骨，佤族地區(qū)常用于治療黃疸型肝炎;23號藥的功效為清熱解毒，利濕退黃，佤族地區(qū)常用于治療濕熱黃疸;24號藥的功效為清熱解毒，佤族地區(qū)常用于治療各型肝炎[8]。實驗表明，除了藥物C外，其余藥物均對肝星狀細胞的生長均有一定的抑制作用，且BDE三個藥物的高濃度組在0-72h時均有非常顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明對治療肝纖維化具有一定的臨床意義。但本實驗依然存在一些實際性的問題，由于佤族習用肝病用藥一直以來僅作為云南少數(shù)民族地區(qū)的治療肝病用藥，對于這些藥的深入研究比較少，尤其是作用到細胞上更是缺乏研究，所以在濃度的設定上沒有一個規(guī)定的參照標準。本實驗設置了3個濃度，通過觀察其在兩個濃度區(qū)間的作用效果，可對佤族習用肝病用藥有效抑制濃度在一個大的濃度區(qū)間進行初步篩選，所篩選得到的濃度并不一定是佤族習用肝病用藥的最佳抑制濃度，為得到這些藥的最佳抑制濃度可在不同濃度梯度進行實驗，本文在此不再贅述;其次本次實驗載體為大鼠肝星狀細胞，還未對活體大鼠進行下一步的實驗，故無法排除所測得的濃度以不同方式給藥對活體大鼠中肝星狀細胞抑制作用情況的影響。

佤族聚居地多屬于亞熱帶低緯度地區(qū)，雨量充沛，山多林密，氣候溫熱，適合多種動植物生長，豐富的動植物是佤藥的來源。佤族醫(yī)藥作為我國民族醫(yī)藥的重要組成部分，皆起源于生產(chǎn)、生活和醫(yī)療實踐的經(jīng)驗總結，在漫長的歷史發(fā)展過程中，為本民族防病治病、生存繁衍，起到了重要的作用，至今仍在廣泛應用。只有進一步對佤族醫(yī)藥進行系統(tǒng)的挖掘、整理、分析和研究，才能更好的使之服務于臨床為人們解除病痛。

參考文獻：

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[8]郭大昌，郭紹榮，段樺.中國佤族醫(yī)藥[M].昆明：云南民族出版社，1997.

（收高日期：2019-09-12）