載紫杉醇的大黃酸偶聯(lián)物膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性與細(xì)胞攝取研究

王曉穎，王夏英，邱梁楨，歐陽(yáng)惠枝，徐 偉

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州350122）

聚合物膠束是由兩親性高分子聚合物在水中自組裝而成的，具有殼-核結(jié)構(gòu)的納米遞藥載體。其疏水內(nèi)核能增溶難溶性藥物；其親水性外殼能提高其在水溶液中的穩(wěn)定性，保護(hù)藥物，減少其在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別從而降低被快速清除的機(jī)率；其納米級(jí)粒徑，利于其攜帶藥物利用腫瘤血管的高通透性通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）被動(dòng)靶向腫瘤部位［1-2］。

載藥聚合物膠束的抗腫瘤活性研究對(duì)預(yù)測(cè)其臨床藥效具有重要意義，一直受到研究者關(guān)注。而體外細(xì)胞研究為其抗腫瘤活性及其機(jī)制研究奠定了研究基礎(chǔ)［3］。本課題組前期用水溶性、生物相容性良好、可降解的羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）與具有抗炎、抗腫瘤、抗腫瘤血管生成的中藥有效成分大黃酸（rhein，R）合成了兩親性的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物（CR偶聯(lián)物）［4］，作為難溶性藥物遞送載體材料，并制備了載抗腫瘤藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）的CR偶聯(lián)物膠束（PTX／CR偶聯(lián)物膠束），本研究對(duì)其MCF-7細(xì)胞毒性及其細(xì)胞攝取進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步抗腫瘤研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

紫杉醇（上海中西三維藥業(yè)有限公司）；CR偶聯(lián)物（自制，大黃酸物質(zhì)的量取代度為7.2%），P4熒光探針由上海復(fù)旦大學(xué)自制提供。透析袋（MWCO14000，上海綠鳥(niǎo)科技發(fā)展有限公司）；磷酸鹽緩沖液（1×）、0.25%胰蛋白酶（1×）、青霉素鏈霉素溶液（美國(guó)HyCloneTM公司）；胎牛血清、人重組胰島素（美國(guó)Sigma公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（德國(guó)BioFroxx公司）；MEM、Glutamax、非必需氨基酸（100×）（美國(guó) Invitrogen公司）；Hoechst 33342（中國(guó)美侖生物公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Zetasizer Nano ZS90型激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司）；ESCALAB 250型X射線光電子能譜儀（美國(guó)VG公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；LSM710型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）；MS105DU十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）。

1.3 細(xì)胞株

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

2 方 法

2.1 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的制備與表征

2.1.1 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的制備［5］本課題組前期完成了透析法對(duì)PTX／CR偶聯(lián)物膠束載藥方法的考察，具體為:7 mg／mL CR偶聯(lián)物水溶液2.6 mL，加入含30 mg／mL PTX的乙醇溶液430μL，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，0.8μm濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，得PTX／CR偶聯(lián)物膠束。并以HPLC法測(cè)得PTX／CR偶聯(lián)物膠束的載藥量為32%。動(dòng)態(tài)激光散射法（DLS）測(cè)得PTX／CR偶聯(lián)物膠束的平均粒徑為（187.8±1.0）nm，PDI為（0.13±0.03）（n＝3），其 Zeta電位為（-31.5±4.2）mV（n＝3）。

2.1.2 X射線衍射（XRD） 將PTX、CR偶聯(lián)物、CR偶聯(lián)物＋PTX的物理混合物、PTX／CR偶聯(lián)物膠束分別置于樣品槽內(nèi)，以5°／min的速度掃描，掃描的角度范圍為3°～45°。測(cè)試電壓及電流分別為20 kV、20 mA，發(fā)射源為Cu-Kα。

2.2 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞懸浮液至每毫升含5×104個(gè)細(xì)胞，向96孔板中每個(gè)孔各加入該細(xì)胞懸浮液100μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁，吸去培養(yǎng)液。設(shè)置不同分組:Cremophor EL-無(wú)水乙醇混合溶劑（1∶1）組、CR偶聯(lián)物組、Taxol?組、PTX／CR偶聯(lián)物膠束組、空白組和正常對(duì)照組。向96孔板中加入上述各組受試液各150μL，Taxol?組和PTX／CR偶聯(lián)物膠束組分別含 PTX濃度為 1、5、10、50、100、500、1 000 nmol／L 6種不同濃度，Cremophor EL-無(wú)水乙醇混合溶劑（1∶1）組和CR偶聯(lián)物組按上述Taxol?組和PTX／CR偶聯(lián)物膠束組所含的溶劑或載體量計(jì)算，以上每個(gè)濃度平行6個(gè)孔，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基和MTT溶液作為空白組，含細(xì)胞不給藥物的細(xì)胞作為正常對(duì)照組，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

分別于加藥后24和48 h，將培養(yǎng)板取出，每孔各加入0.5 mg／mL MTT溶液100μL，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出，小心吸取上清液。每孔各加入DMSO 150μL溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸收度（A）。并根據(jù)各孔的吸收度，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞的存活率:

2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.3.1 共載P4和PTX的CR偶聯(lián)物膠束的制備

稱(chēng)取CR偶聯(lián)物18 mg，加蒸餾水2.6 mL室溫下冰水浴探頭超聲10 min使其充分溶解。稱(chēng)取PTX 12.86 mg，精密稱(chēng)定，溶于P4的甲醇溶液（200μg／mL）200μL中，超聲使其溶解并混勻，然后逐滴加至CR偶聯(lián)物膠束溶液中，劇烈攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，透析12 h后，結(jié)束透析定容至6 mL，冰水浴探頭超聲 20 min，3 500 r／min離心5 min，取上清液，得共載P4和PTX的CR偶聯(lián)物膠束，即（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束。

2.3.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞以每毫升含1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿上，每孔加入該細(xì)胞懸浮液1 mL，培養(yǎng)至4 d。從培養(yǎng)箱中取出激光共聚焦皿，棄去培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)熱的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞3次。加入各含藥制劑0.5 mL，孵育2 h后，棄去藥液，加入4℃的冰冷PBS終止攝取，清洗細(xì)胞3次。棄去PBS溶液，用4%多聚甲醛固定20 min，冷PBS清洗5次，加入10μg／mL細(xì)胞核染色液 Hoechst 33342 1 mL繼續(xù)孵育15 min，用冷PBS清洗3次后加入 PBS 200μL，于激光共聚焦顯微鏡（CLSM）下觀察并拍照。

2.3.3 流式細(xì)胞半定量實(shí)驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞以每毫升含2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板上，每孔加入該細(xì)胞懸浮液2 mL，培養(yǎng)至4 d。用PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，加入各含藥制劑1 mL，于37℃孵育2 h后，移除藥液，加入4℃的冰冷PBS終止攝取，清洗細(xì)胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入含血清的培養(yǎng)液吹散細(xì)胞。收集細(xì)胞，離心，然后加入PBS洗滌、離心如此重復(fù)3次后加入PBS 0.5 mL將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

3 結(jié) 果

3.1 XRD測(cè)定結(jié)果

PTX、CR偶聯(lián)物、CR偶聯(lián)物＋PTX物理混合物以及PTX／CR偶聯(lián)物膠束的XRD圖譜見(jiàn)圖1。PTX在5.1°和12.8°處有2個(gè)強(qiáng)吸收峰，在15°～30°之間又有若干個(gè)弱峰。CR偶聯(lián)物僅在20°有一較弱吸收峰。CR偶聯(lián)物＋PTX物理混合物圖譜具有明顯的PTX和CR偶聯(lián)物的特征吸收峰，而PTX／CR偶聯(lián)物膠束圖譜中僅5.1°處有較明顯的吸收峰，可能是凍干前PTX／CR偶聯(lián)物膠束釋放在水溶液中的少量游離PTX造成的，但與相同量CR偶聯(lián)物與PTX物理混合物的XRD圖相比，PTX其他各吸收峰極弱，推測(cè)大部分PTX可能以無(wú)定型狀態(tài)包載于膠束內(nèi)部。

Figure 1 X-Ray diffraction spectraa:Paclitaxel（PTX）；b:Carboxymethyl chitosan-rhein conjugate（CR conjugate）；c:CR conjugate and PTX mixture；d:Paclitaxel-loaded carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles（PTX／CR PMs）

3.2 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MTT法檢測(cè)Taxol?的溶劑Cremophor EL-無(wú)水乙醇混合溶劑（1∶1）、CR偶聯(lián)物、Taxol?及 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的細(xì)胞毒性的結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CR偶聯(lián)物具有良好的安全性。Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束均對(duì)MCF-7細(xì)胞有一定的抑制率。24和48 h時(shí)，Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用均隨著PTX濃度的增加而增強(qiáng)，表明Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷作用均有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。24 h時(shí)，在10～1 000 nmol／L范圍內(nèi)，PTX／CR偶聯(lián)物膠束表現(xiàn)出比Taxol?更好的細(xì)胞殺傷力。PTX／CR偶聯(lián)物膠束24 h的IC50為293.9 nmol／L。48 h時(shí)，PTX／CR偶聯(lián)物膠束與Taxol?對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷力相近。

3.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步考察CR偶聯(lián)物膠束以載藥膠束完整的形式被細(xì)胞攝取還是釋放藥后藥物以游離的形式被細(xì)胞攝取，環(huán)境響應(yīng)型熒光探針P4被應(yīng)用于細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。利用CLSM定性觀察（圖3）和流式細(xì)胞儀定量測(cè)定（圖4）的方法對(duì)P4與PTX共載的（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束在MCF-7細(xì)胞中的攝取情況進(jìn)行了研究。CLSM拍攝的MCF-7細(xì)胞攝取照片（圖3）中，紅色熒光信號(hào)為P4熒光探針發(fā)出，藍(lán)色熒光信號(hào)為Hoechst 33342染色的細(xì)胞核。圖中顯示，游離的P4溶液處于水環(huán)境中，熒光淬滅，因此只能觀察到藍(lán)色的細(xì)胞核，而（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束組的紅色熒光主要分布在細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）周?chē)?，說(shuō)明（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束主要分布于細(xì)胞質(zhì)。與此同時(shí)，給予MCF-7細(xì)胞相同濃度的制劑并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，其結(jié)果如圖4所示，游離P4溶液的熒光強(qiáng)度極弱，可認(rèn)為是細(xì)胞自身所發(fā)出的熒光，而（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束的熒光強(qiáng)度是游離P4的500倍以上，表明（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束是以完整的膠束形式被MCF-7細(xì)胞內(nèi)吞攝入，這些結(jié)果與通過(guò)CLSM觀察的結(jié)果相吻合，這為之后體內(nèi)的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

CLSM觀察結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束加維拉帕米組的細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，其與（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束在MCF-7細(xì)胞中的攝取量無(wú)明顯差異，說(shuō)明CR偶聯(lián)物膠束可以保護(hù)其所載的熒光探針和／或藥物不被P-糖蛋白（P-gp）外排到細(xì)胞外。

Figure 2 In vitro cytotoxicity of CR conjugate and PTX／CR PMs in MCF-7 cells after incubation for 24 hours（A）and 48 hours（B）（xˉ±s，n＝6）EtOH＋EL:Dehydrated ethanol-Cremophor EL（1∶1）**P＜0.01

Figure 3 Cellular uptake of P4 and PTX co-loaded carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles［（P4＋PTX）／CR PMs］in MCF-7 cells by confocal laser sanning microscopeVer:Verapamil

Figure 4 Cellular uptake of（P4＋PTX）／CR PMs in MCF-7 cells by flow cytometry（xˉ±s，n＝3）

4 討 論

PTX主要是通過(guò)抑制微管解聚，阻止腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，因而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用［6-7］。因此，聚合物膠束是否能夠遞送PTX到達(dá)細(xì)胞內(nèi)其作用靶點(diǎn)上，對(duì)能否對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTX／CR偶聯(lián)物膠束主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，與紫杉醇作用部位相一致，有利于紫杉醇抗腫瘤作用的發(fā)揮。

PTX／CR偶聯(lián)物膠束在24 h時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)于Taxol?對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷效果，本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證明CR偶聯(lián)物與PTX具有一定的協(xié)同抗腫瘤作用［4］，因此推測(cè)，其對(duì)MCF-7細(xì)胞良好的細(xì)胞殺傷作用可能與載體材料CR偶聯(lián)物與PTX的協(xié)同作用相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中所使用的熒光探針P4為上海復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院吳偉教授課題組開(kāi)發(fā)的具有4，4′-二氟-4-硼-3α，4α-二氮雜-s-并二苯（BODIPY）結(jié)構(gòu)的熒光探針。這種熒光探針在水環(huán)境中熒光分子因疏水作用會(huì)發(fā)生分子間π-π堆積，使熒光發(fā)生 淬 滅 （aggregation-caused quenching，ACQ效應(yīng)）［8-10］。該ACQ探針具有高度親脂性，可以緊密嵌入脂質(zhì)或包裹在聚合物膠束內(nèi)部中從而發(fā)出熒光信號(hào)。一旦聚合物膠束解聚或探針從膠束中泄漏，熒光探針即因被釋放進(jìn)入水環(huán)境中而快速聚集發(fā)生熒光淬滅，從而與保留在聚合物膠束中的熒光探針發(fā)射出的強(qiáng)烈熒光信號(hào)形成鮮明對(duì)比，由此可以判斷納米膠束在細(xì)胞內(nèi)外的完整性。以P4為熒光探針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CR偶聯(lián)物膠束是以完整形態(tài)進(jìn)入MCF-7腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并且可以保護(hù)其所載熒光探針和／或藥物避免被P-gp外排到細(xì)胞外，此研究將為CR偶聯(lián)物的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝復(fù)旦大學(xué)吳偉教授和趙偉利教授提供P4探針。感謝閩臺(tái)中藥分子生物技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建省中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省中藥資源研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)本研究的支持。