鮑小強

（中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京210009）

抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic associated diarrhea，AAD）是臨床常見腹瀉類型，與抗生素應(yīng)用有關(guān)。近年來，隨著感染性疾病發(fā)病率逐漸升高及廣譜抗生素濫用現(xiàn)象加重，AAD發(fā)生率隨之增加，有調(diào)查顯示［1］，其發(fā)病率達5%～39%，尤其是小兒患者更易發(fā)生AAD，給患兒生長發(fā)育造成不利影響。目前，臨床中多采用停用抗生素或更換窄譜抗生素治療AAD，治療效果均不理想，甚至部分患者出現(xiàn)腹瀉癥狀加重現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，AAD患者存在腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜屏障功能受損及免疫功能下降等現(xiàn)象［2］，因此，亟需尋找有效藥物改善腸道微生態(tài)、黏膜屏障及免疫功能對疾病治療有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)作用，且安全性較好，成為臨床研究熱點［3］。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，LC）、納豆芽孢桿菌（Bacillus subtiliis natto，BN）是目前常用于制備微生態(tài)制劑的菌種，臨床已有應(yīng)用LC或BN單一微生態(tài)制劑治療化療相關(guān)性腹瀉的報道［4］，取得良好效果，但仍有部分患者治療效果不佳。共培養(yǎng)是應(yīng)用兩種或兩種以上微生物共同發(fā)酵，以獲得更高受益的一種發(fā)酵技術(shù)［5］，為探討更好的治療AAD方法，本研究利用LC與BN間的互利共生關(guān)系，將二者的共培養(yǎng)上清液應(yīng)用于AAD小鼠治療中，重點探討其對AAD小鼠腸道微生態(tài)、黏膜屏障功能及免疫功能的影響，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

LC、BN（中國普通微生物菌種保藏管理中心）；鹽酸林可霉素注射液（山東新華制藥股份有限公司，規(guī)格:2 mL∶0.6 g，批號1807110701）；乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球選擇性培養(yǎng)基（青島海博生物計數(shù)有限公司）；糞便QIAamp?DNA Stool Mini Kit（德國Qiagen公司）；小鼠分泌型免疫球蛋白 A（secreted immunoglobulin A，sIgA）試劑盒（美國 Rapidbio公司）；白介素（interleukin，IL）-2、IL-4 ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；緊密連接相關(guān)蛋白-1（tight junction-associated protein-1，ZO-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、β-actin多抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG（美國Abcam公司）。

1.2 儀 器

HD325C型生物切片機（湖北醫(yī)療器械七廠）；E200型光學(xué)顯微鏡（Nikon儀器上海有限公司）；3550UV酶標(biāo)儀、7500實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）。

1.3 動 物

SPF級昆明種小鼠，50只，雌雄各半，4周齡，13～15 g，由中國藥科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（蘇）2018-0004。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 LC、BN共培養(yǎng)上清液制備

將BN、LC按照菌體數(shù)1∶2比例接種于優(yōu)化培養(yǎng)基（葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、麩皮、硫酸錳、硫酸鎂、無水乙酸鈉、磷酸二氫鉀分別占比1.32%、0.68%、1.50%、0.50%、0.005%、0.02%、0.05%、0.20%）中，接種量為4%，裝液量40%，溫度設(shè)置為37℃，靜置培養(yǎng)30 h，離心獲得共培養(yǎng)上清液；同時分別單獨接種LC、BN，獲得上清液，4℃保存?zhèn)溆茫ɑ罹鷶?shù)約1×1011CFU／L，干質(zhì)量約39 g／L）。

2.2 模型制備及分組干預(yù)

選取小鼠50只，其中40只參照文獻［6］建立AAD小鼠模型:每次給予灌胃鹽酸林可霉素0.4 mL，每日2次，連續(xù)4 d，觀察小鼠排便情況，出現(xiàn)黃褐色、稀爛、不成形糞便，且新鮮糞便培養(yǎng)雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量下降，則建模成功，將建模成功小鼠隨機分為模型組、LC組、BN組及共培養(yǎng)組；其余10只小鼠灌胃生理鹽水，設(shè)為對照組。第5 d開始LC組、BN組及共培養(yǎng)組分別灌胃LC、BN及共培養(yǎng)上清液30 mL／kg，模型組和對照組分別灌胃等量生理鹽水溶液，連續(xù)給藥4 d，所有小鼠均自由飲水和采食。

2.3 觀察小鼠一般情況及樣本采集

觀察干預(yù)期間各組小鼠精神狀態(tài)、采食量、糞便等一般情況；末次給藥2 h，稱重后處死各組小鼠，立即剖檢取脾臟及胸腺，剔除表面筋膜及脂肪組織，稱重并計算脾臟和胸腺的體質(zhì)量比。

2.4 組織病理學(xué)觀察

取近端結(jié)腸病變區(qū)組織，對照組取同位置健康組織，10%中性甲醛固定，酒精脫水、石蠟包埋，制作厚度為4μm的石蠟切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，以中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。

2.5 盲腸內(nèi)容物菌群豐度及多樣性檢測

無菌收集各組小鼠盲腸內(nèi)容物，采用糞便DNA基因組提取試劑盒提取總DNA，進行細菌16SrDNA V4可變區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，引物序列如下。F:5′-ATGCTACGTAGCTAGCT-3′； R:5′-TATCGTACGTAGCTCAC-3′，反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性4 min；98℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸30 s，重復(fù)27個循環(huán)，72℃延伸5 min。應(yīng)用Illumina Misq技術(shù)對PCR產(chǎn)物進行高通量測序，對測序結(jié)果進行分析、處理后獲得代表序列，按照0.97相似度進行聚類，以獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），應(yīng)用軟件 MEGAN分析計算多樣性（Shannon）指數(shù)和豐富度（Chao）指數(shù)。

2.6 盲腸內(nèi)容物優(yōu)勢菌群檢測

無菌收集各組小鼠盲腸內(nèi)容物100μg，加入稀釋液800μL充分混勻，再次稀釋，選取1×10-3～1×10-8稀釋度混懸液接種至選擇性培養(yǎng)基，分別放置于37℃培養(yǎng)箱和厭氧菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進行細菌鑒定及計數(shù)，用對數(shù)值代表活菌的優(yōu)勢菌數(shù)量（lgCFU／g）。

2.7 腸道屏障功能血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）及細菌異位率檢測

處死前收集各組小鼠眼球血樣，室溫靜置分層后，4℃離心收集上層血清，應(yīng)用分光光度計法測定血清DAO水平，于酶標(biāo)儀436 nm處讀取吸收度。無菌獲取小鼠腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLN）、腹腔灌洗液、肝、腎、肺，分別置于增菌液，需氧條件培養(yǎng)24 h，或厭氧條件培養(yǎng)48 h（35℃），挑取增菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本涂片鑒定，有大腸埃希菌或類桿菌者記為陽性，計算細菌異位率。細菌異位率（%）＝陽性器官個數(shù)／（小鼠只數(shù) ×5）。

2.8 腸黏膜中sIgA及腸組織中 IL-2、IL-4水平檢測

取各組小鼠緊鄰回盲部2 cm腸段組織，縱向鋪平，生理鹽水輕輕沖洗表面，然后用載玻片刮取腸道內(nèi)容物及黏液，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）1.0 mL勻漿，1 000 r／min離心15 min；另收集上清液取近端結(jié)腸病變區(qū)組織，同法勻漿、離心收集上清液，采用ELISA法檢測腸黏膜內(nèi)sIgA及腸組織中IL-2、IL-4含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定 492 nm（sIgA）或450 nm（IL-2、IL-4）波長處吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢樣品含量。

2.9 腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達情況檢測

取各組小鼠緊鄰回盲部腸段組織75 mg，加入液氮研磨，加入細胞裂解液，至于沸水浴10 min，12 000 r／min離心15 min取上清液，采用BCA法測定蛋白總量，取樣本30μg與等體積上樣緩沖液混勻，再次離心取上清液，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳 SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜60 min，加入封閉液孵育2 h，洗膜3次后加入稀釋一抗，4℃搖床孵育過夜，加入稀釋二抗，常溫孵育1 h，暗室中曝光、顯影。應(yīng)用Quantity One軟件進行灰度分析，以待測蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值表示其相對表達量。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)工具SPSS 20.0分析處理數(shù)據(jù)，計量資料均以（±s）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠一般狀態(tài)觀察及胸腺、脾臟的體質(zhì)量比對比

連續(xù)灌胃4 d鹽酸林可霉素后，40只小鼠均建模成功，將其分為模型組、LC組、BN組及共培養(yǎng)組，各10只。對照組小鼠，精神狀態(tài)、采食量、糞便性狀均無異常；模型組小鼠造模初期采食量下降、毛色暗淡，隨時間延長，出現(xiàn)活動量減少、喜臥、體質(zhì)量下降、糞便溏泄；LC、BN及共培養(yǎng)組干預(yù)后，上述狀態(tài)均有所改善，體質(zhì)量有所回升，糞便性狀改善，逐漸成型，其中共培養(yǎng)組恢復(fù)情況最佳。與對照組相比，模型組胸腺、脾臟的體質(zhì)量比均較低（P＜0.05）；與模型組相比，各干預(yù)組胸腺、脾臟的體質(zhì)量比均較高（P＜0.05），其中共培養(yǎng)組胸腺、脾臟的體質(zhì)量比高于LC組、BN組（P＜0.05），而LC組與 BN組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

Table 1 Thymus and spleen weight ratios of different interrention mice（xˉ±s，n＝10）

3.2 腸道組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，對照組腸壁結(jié)構(gòu)、形態(tài)等均無異常；模型組腸壁組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，組織絨毛脫落，可見纖維素樣滲出、上皮細胞壞死、大量炎性細胞浸潤；LC和BN組腸壁結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但仍見少量腸黏膜上皮細胞水腫及少量炎性細胞浸潤，共培養(yǎng)組腸壁結(jié)構(gòu)基本正常，無黏膜損傷，但仍見少量炎性細胞浸潤（見圖1）。

Figure 1 Intestinal histopathological observation（HE，×400）A:Control；B:Model；C:LC；D:BN；E:Co-culture

3.3 盲腸內(nèi)容物菌群豐度及多樣性對比

與對照組相比，模型組Shannon、Chao指數(shù)較低，乳桿菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)較少，腸桿菌數(shù)、腸球菌數(shù)較多（P＜0.05）；與模型組相比，各干預(yù)組Shannon、Chao指數(shù)較高，乳桿菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)較多，腸桿菌數(shù)、腸球菌數(shù)較少（P＜0.05）；與LC組、BN組比較，共培養(yǎng)組Shannon、Chao指數(shù)較高，乳桿菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)較多，腸桿菌數(shù)、腸球菌數(shù)較少（P＜0.05）；LC組與 BN組 Shannon、Chao指數(shù)及優(yōu)勢菌群數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

Table 2 Comparison of intestinal flora abundance and diversity（±s，n＝10）

Table 2 Comparison of intestinal flora abundance and diversity（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group Shannon index Chao index Enterobacter／（lgCFU／g）Enterococcus／（lgCFU／g）Lactobacillus／（lgCFU／g）Bifidobacterium／（lgCFU／g ）Control 4.19±0.35 820.50±46.27 7.41±0.77 7.01±0.54 8.91±0.72 8.94±0.71 Model 2.42±0.21* 604.31±32.29* 10.31±0.86* 8.76±0.67* 6.52±0.59* 6.21±0.62*LC 2.96±0.28*△ 682.02±35.46*△ 9.49±0.81*△ 8.12±0.61*△ 7.11±0.61*△ 7.39±0.69*△BN 2.98±0.30*△ 685.48±38.62*△ 9.50±0.87*△ 8.11±0.58*△ 7.15±0.65*△ 7.40±0.70*△Co-culture 3.54±0.31*△▲＃ 733.89±40.81*△▲＃ 8.34±0.88*△▲＃ 7.56±0.51*△▲＃ 8.02±0.70*△▲＃ 8.10±0.85*△▲＃

3.4 腸道屏障功能對比

與對照組相比，模型組血清DAO、細菌異位率均較高（P＜0.05）；與模型組相比，各干預(yù)組血清DAO、細菌異位率均較低（P＜0.05），其中共培養(yǎng)組血清 DAO、細菌異位率均低于 LC組、BN組（P＜0.05）；LC組與BN組比較、對照組與共培養(yǎng)組比較，血清DAO、細菌異位率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表3）。

3.5 腸黏膜中 sIgA、腸組織中 IL-2、IL-4水平及IL-2／IL-4對比

與對照組相比，模型組sIgA、IL-2及IL-2／IL-4均較低，IL-4較高（P＜0.05）；與模型組相比，各干預(yù)組 sIgA、IL-2及 IL-2／IL-4均較高，IL-4較低（P＜0.05）；與LC組、BN組比較，共培養(yǎng)組 sIgA、IL-2及 IL-2／IL-4均較高，IL-4較低（P＜0.05）；LC組與BN組比較、共培養(yǎng)組與對照組比較，sIgA、IL-2、IL-4水平及 IL-2／IL-4差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表4）。

Table 3 Comparison of intestinal barrier function（±s，n＝10）

Table 3 Comparison of intestinal barrier function（±s，n＝10）

DAO:diamine oxidase*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group Serum DAO（A）Bacterial ectopic rate／%Control 0.180±0.020 15.71±1.97 Model 0.381±0.024* 52.30±5.22*LC 0.215±0.021*△ 29.15±3.10*△BN 0.210±0.018*△ 29.03±2.38*△Co-culture 0.182±0.014△▲＃ 16.32±2.11△▲＃

Table4 sIgA in intestinal mucosa，IL-2 and IL-4 levels in intestinal tissue and IL-2／IL-4 comparison（±s，n＝10）

Table4 sIgA in intestinal mucosa，IL-2 and IL-4 levels in intestinal tissue and IL-2／IL-4 comparison（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group SIgA／（μg／mL） IL-2／（pg／mL） IL-4／（pg／mL）IL-2／IL-4 Control 1.12±0.09 175.50±10.20 60.55±5.53 2.90±0.24 Model 0.73±0.06* 140.32±9.62* 138.89±10.25* 1.01±0.12*LC 0.85±0.07*△ 149.77±8.74*△ 118.57±10.31*△ 1.26±0.20*△BN 0.86±0.08*△ 150.22±8.95*△ 117.32±9.27*△ 1.28±0.13*△Co-culture 1.05±0.10△▲＃ 170.61±9.30△▲＃ 65.42±6.20△▲＃ 2.60±0.21*△▲＃

3.6 腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量比較

與對照組相比，模型組腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量均較低（P＜0.05）；與模型組相比，各干預(yù)組腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量均較高（P＜0.05），其中共培養(yǎng)組腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量高于LC組、BN組（P＜0.05），而LC組與BN組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表5，圖2）。

Table 5 Comparison of relative expressions of ZO-1 and Occludin in intestinal tissues（xˉ±s，n＝10）

Figure2 Expression of ZO-1 and Occludin in intestinal tissues detected by Western blotA:Control；B:Model；C:LC；D:BN；E:Co-culture

4 討 論

AAD是腹瀉常見類型，任何年齡均可發(fā)病，多見于老年人、小兒及長期應(yīng)用抗生素者，以腹痛、水樣瀉為典型癥狀，嚴重者可出現(xiàn)血便、甚至休克現(xiàn)象，危及患者生命［7］。AAD主要包括單純腹瀉、結(jié)腸炎及偽膜性腸炎3個類型，發(fā)病機制主要為抗生素大量應(yīng)用，腸道益生菌被抑制，腸道微環(huán)境中乙酸、丙酸等有機酸異常升高，導(dǎo)致腸道上皮細胞功能紊亂、通透性改變，最終導(dǎo)致腹瀉發(fā)生［8-9］。因此，抗生素引起腸道微生態(tài)失衡、黏膜屏障功能障礙在AAD發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且黏膜屏障功能對維持腸道正常免疫功能有重要意義，因此，從調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、改善屏障功能和免疫功能著手是提高AAD治療效果的關(guān)鍵。

LC主要分布于口腔、腸道內(nèi)容物及陰道中，屬于乳桿菌屬；BN廣泛分布于自然界及動物及人腸道中，屬于可形成內(nèi)生孢子的革蘭陽性桿菌，穩(wěn)定性強，對儲藏條件要求不嚴格，且可耐受胃內(nèi)酸性環(huán)境，LC及BN均是臨床中廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)微生物制劑的益生菌［10］。趙謀明等［11］研究發(fā)現(xiàn)，BN液態(tài)發(fā)酵代謝物中含有納豆激酶（nattokinase，NK）、肽類等活性物質(zhì)，而NK已被證實具有抗氧化、強溶栓功效。另有研究發(fā)現(xiàn)，吡咯喹啉醌（pyrroquinoline quinone，PQQ）是 BN發(fā)酵后生成的另一種活性代謝物，PQQ作為氧化還原酶的輔酶，廣泛分布于組織器官中，是機體生長發(fā)育的必需因子，同時具有刺激微生物生長的作用［12］。研究表明，乳酸菌、納豆菌等益生菌之間具有互利共生關(guān)系［13］，徐微微等［14］研究證實 BN與 LC接種比為1∶2時可使共培養(yǎng)液中NK活力及PQQ濃度達到最大。本研究應(yīng)用LC、BN上清液及共培養(yǎng)上清液（BN、LC接種比1∶2）干預(yù)后，各組小鼠腹瀉、采食量等一般狀況及腸道組織病理情況均有所改善，其中共培養(yǎng)組恢復(fù)情況最佳，說明LC和BN共培養(yǎng)上清液有助于AAD病情恢復(fù)。此外，本研究中各干預(yù)組胸腺、脾臟體質(zhì)量比、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、乳桿菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)均高于模型組，其中共培養(yǎng)組高于LC組、BN組；各干預(yù)組腸桿菌數(shù)、腸球菌數(shù)均低于模型組，其中共培養(yǎng)組低于LC組、BN組，提示LC和BN共培養(yǎng)上清液在提高AAD小鼠腸道菌群豐度及多樣性方面有積極促進作用，有助于改善腸道微生態(tài)。

生理狀態(tài)下，腸道各菌群間處于共生與拮抗平衡狀態(tài)，AAD狀態(tài)下，腸道微生態(tài)平衡被打破，細菌多樣性及優(yōu)勢菌群改變，導(dǎo)致有害代謝產(chǎn)物增多，腸道屏障功能及免疫功能均受到影響。DAO是分布于小腸黏膜上層絨毛中的一種胞內(nèi)酶，其血清水平升高提示血清水平升高提示腸道屏障功能受損［15］；當(dāng)腸道屏障功能受損或腸道通透性升高時，可出現(xiàn)腸道細菌異位現(xiàn)象［16］，可引起腸源性感染。本研究應(yīng)用LC、BN上清液及共培養(yǎng)上清液干預(yù)后，各干預(yù)組血清DAO、細菌異位率、腸組織IL-4均較低，其中共培養(yǎng)組低于LC組、BN組，提示共培養(yǎng)上清液可有效抑制細菌異位的發(fā)生發(fā)展，改善AAD腸道屏障功能。緊密連接蛋白家族成員ZO-1、Occludin蛋白是維持腸黏膜屏障功能完整性的重要蛋白，本研究經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達升高，其中共培養(yǎng)組升高最為明顯，進一步證實LC和BN共培養(yǎng)上清液可能通過促進腸道緊密連接蛋白表達，進而改善腸道黏膜屏障功能。sIgA是腸黏膜免疫中的關(guān)鍵抗體，其水平降低提示機體黏膜免疫功能被抑制，加劇疾病進程［17］。IL-2、IL-4是分別由 Th1、Th2細胞分泌的活性因子，同時IL-2、IL-4參與調(diào)節(jié)Th0細胞向Th1、Th2細胞分化過程，在機體細胞免疫及體液免疫中發(fā)揮重要作用［18］。生理狀態(tài)下Th1、Th2處于動態(tài)平衡狀態(tài)，兩者失衡可導(dǎo)致機體免疫功能失調(diào)，加速疾病進展。本研究應(yīng)用LC、BN上清液及共培養(yǎng)上清液干預(yù)后，各干預(yù)組腸黏膜中sIgA、腸組織IL-2及IL-2／IL-4均較高，其中共培養(yǎng)組高于LC組、BN組，提示LC和BN共培養(yǎng)上清液在改善AAD腸道免疫功能方面有積極促進作用。

綜上所述，LC和BN共培養(yǎng)上清液可有效調(diào)節(jié)AAD小鼠腸道微生態(tài)，改善腸黏膜屏障功能，提高腸道局部及整體免疫功能，為臨床應(yīng)用共培養(yǎng)益生菌制劑治療AAD提供了理論依據(jù)。