阮福娜 白倩 陳一帆 劉陽 楊子玥 蘇淑釵

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

黃連木(Pistaciachinensis)，又稱中國黃連木，別名楷樹、楷木、藥木和黃連茶等，屬于漆樹科(Anacardiaceae)黃連木屬(PistaciaL.)植物。黃連木是落葉喬木，在我國分布廣泛，黃連木的最佳適生區(qū)位于太行山區(qū)的冀豫晉陜等集中地域，且河北邯鄲地區(qū)分布最多[1-2]。以往一直認(rèn)為黃連木屬植物均為雌雄異株[3-4]，且自然分布的黃連木雌株少雄株多，后來陸續(xù)在阿月渾子(P.veraL.)、大西洋黃連木(P.atlanticaDesf)發(fā)現(xiàn)雌雄同株樹[5-9]。2008年林業(yè)專家在河南省林州市進(jìn)行考查時(shí)，發(fā)現(xiàn)了7棵樹齡30 a左右且分布相對(duì)集中的雌雄同株中國黃連木[10]。王文浩等[11]在河北省唐縣發(fā)現(xiàn)了23棵雌雄同株黃連木，進(jìn)一步研究表明，雌雄同株黃連木的配子體均具有育性，雌雄異株的雌株、雄株和雌雄同株植株間具有雜交親和性。黃連木是一種重要的木本油料作物，為了提高其果實(shí)產(chǎn)量，需要合理的雌雄樹配比，如果能開發(fā)雌雄同株黃連木資源，將有利于節(jié)約土地資源與人力，促進(jìn)豐產(chǎn)。因此，深入開展雌雄同株黃連木的研究，不僅對(duì)其種質(zhì)資源的鑒定和保存具有重要意義，而且在生產(chǎn)上具有重要應(yīng)用前景。

SSR(Simple sequence repeats)標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果多態(tài)性豐富、遺傳信息量大等優(yōu)點(diǎn)[12]，目前已被用于黃連木屬植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析、品種鑒定、分類和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面[13-16]。對(duì)雌雄同株黃連木的研究主要集中在生物學(xué)特性、雌雄配子體育性、花粉活性、結(jié)果習(xí)性、變異情況以及不同枝營養(yǎng)元素動(dòng)態(tài)差異方面[11]，并未涉及雌雄同株黃連木的親緣關(guān)系研究。因此，本研究在河南林州和河北唐縣擴(kuò)大調(diào)查范圍，尋找更多的雌雄同株樹，并探究雌雄同株樹上不同性別類型的基因型穩(wěn)定性。同時(shí)采用14個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)4個(gè)地區(qū)的黃連木進(jìn)行了親緣關(guān)系鑒定，為雌雄同株黃連木的起源和演化提供分子水平的理論依據(jù)，對(duì)科學(xué)有效制定雌雄同株黃連木資源保護(hù)策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

在河南馬鞍山、河南西齊、河北老姑和河北楊家庵4個(gè)地區(qū)，實(shí)地調(diào)查尋找雌雄同株黃連木，通過文本、數(shù)據(jù)和圖像記錄4個(gè)地區(qū)的地理位置、人為干擾程度，同時(shí)記錄每棵雌雄同株樹的花序類型和分布、雌雄同株樹的分布比例。

通過調(diào)查，在河北和河南4個(gè)地區(qū)共收集了140個(gè)樣本，即70棵雌雄同株樹，54棵雌樹和16棵雄樹(表1)。每個(gè)地區(qū)雌雄同株和雌雄異株樹數(shù)量基本相等，同時(shí)每棵雌雄異株樹間隔50 m以上。在河北楊家庵地區(qū)，當(dāng)?shù)鼐用裾J(rèn)為黃連木雄樹不能結(jié)實(shí)，與雌樹相比沒有價(jià)值，因此被大量砍伐。而河南西齊地區(qū)雄樹太少，因此這兩個(gè)地區(qū)都沒有采集雄樹樣本?；诨蛐头€(wěn)定性研究，在這4個(gè)地區(qū)的70棵雌雄同株黃連木中隨機(jī)選取9棵，采集每棵雌雄同株樹上的不同性別類型的花序(包括雌花序、雄花序、混合花序和兩性花)，立即放入干燥的自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后，放在冰箱中-80 ℃保存。

表1 4個(gè)黃連木地區(qū)基本情況收集點(diǎn)的信息

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

基因組DNA的提取使用新型植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)。DNA純度和質(zhì)量濃度使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性后，將其稀釋至30 mg/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

本研究基于阿月渾子的SSR原始擴(kuò)增條件[17]，建立了適合中國黃連木的擴(kuò)增反應(yīng)體系：15 ng模板DNA，5 μL的PCR MIX混合液(Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑)，正反引物各0.25 μL，ddH2O 4 μL，共10 μL的反應(yīng)體系。

SSR擴(kuò)增程序分為兩個(gè)連續(xù)步驟：第一步在94 ℃下初始變性3 min，然后進(jìn)行23個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94 ℃變性30 s，54～60 ℃退火45 s和72 ℃伸長(zhǎng)60 s；第二步包括10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s和72 ℃延伸60 s，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 引物篩選

表2 14對(duì)SSR引物的序列特征和來源

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(5×TBE溶液3.7 mL、30%丙烯酰胺溶液母液8.8 mL、ddH2O 23.1 mL、TEMED 24 μL、10% APS(過硫酸銨)259 μL)電泳分離，150 V恒壓。銀染后觀察、拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果，對(duì)清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從大到小依次標(biāo)記為A、B、C…，純合基因型用相同字母標(biāo)記，如AA、BB、CC…；雜合基因型用不同字母標(biāo)記，如AB、AC、BC…，并建立數(shù)據(jù)矩陣。用NEI[19]的計(jì)算法估計(jì)遺傳距離(GD)和遺傳一致度(GI)。根據(jù)遺傳距離和遺傳一致度，用NTSYS-pc2.1[20]軟件對(duì)4個(gè)地區(qū)140個(gè)黃連木個(gè)體進(jìn)行UPGMA聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌雄同株樣本花序類型和分布

根據(jù)種質(zhì)資源調(diào)查，在河南馬鞍山、河南西齊、河北老姑和河北楊家庵4個(gè)地區(qū)分別發(fā)現(xiàn)了22、11、33、4棵雌雄同株黃連木。部分雌雄同株樹著生4種不同類型的花序，包括雌花序、雄花序、混合花序和兩性花。在河北老姑和楊家庵地區(qū)，黃連木雌樹樹齡大約60 a，有幾棵樹大約20 a或者超過100 a，而雄樹大約20 a，雌雄同株樹的樹齡與雌樹的樹齡相似[21]。在河南馬鞍山地區(qū)，雌樹、雄樹和雌雄同株樹的樹齡大約10～30 a，有幾棵樹大約是50 a。在河南西齊地區(qū)，雌樹、雄樹和雌雄同株樹的樹齡大約是50 a。

河南和河北4個(gè)野生黃連木地區(qū)雌雄同株樹的花序類型和分布分別見表3和表4?？梢钥闯鲈诤幽像R鞍山地區(qū)，著生4、3、2種花序類型的雌雄同株樹分別有7、2、13株；在河南西齊地區(qū)，著生4、3、2種花序類型的雌雄同株樹分別有4、3、4株。在河北老姑地區(qū)，著生4、3、2種花序類型的雌雄同株樹分別有7、15、11株；在河北楊家庵地區(qū)，沒有存在4種花序類型的雌雄同株樹，存在3、2種花序類型的雌雄同株樹分別有1、3株。在河南馬鞍山和西齊地區(qū)，雌雄同株樹上兩性花的數(shù)量多于混合花序的數(shù)量，雌花序和雄花序的數(shù)量基本相等；而在河北老姑和楊家庵地區(qū)，混合花序的數(shù)量多于兩性花的數(shù)量，雌花序的數(shù)量多于雄花序的數(shù)量。

2.2 SSR標(biāo)記的基因型穩(wěn)定性

SSR標(biāo)記位點(diǎn)ptms-7呈現(xiàn)的9棵雌雄同株黃連木及每棵雌雄同株樹不同性別類型花序的DNA圖譜如圖1所示。結(jié)果表明不同的雌雄同株黃連木的gDNA圖譜存在差異，而同一株雌雄同株樹不同性別類型花序的gDNA圖譜無差異，即雌雄同株樹上無特殊標(biāo)記的DNA條帶。

表3 河南馬鞍山和西齊地區(qū)33個(gè)雌雄同株樣本花序類型和分布

序號(hào)樣本編號(hào)花序類型和分布1YMMo-12種類型;較多的雌花序和非常少的雄花序2YMMo-23種類型;較多的雄花序和兩性花,較少的雌花序3YMMo-32種類型;雄花序∶雌花序=6∶44YMMo-44種類型;較多的雌花序和兩性花,較少的雄花序和混合花序5YMMo-52種類型;雄花序∶雌花序=7:36YMMo-62種類型;較多的雌花序和較少的雄花序7YMMo-74種類型;較多的雌花序和雄花序,較少的混合花序和兩性花8YMMo-84種類型;較多的雌花序和兩性花,較少的雄花序和混合花序9YMMo-94種類型;較多的混合花序和兩性花,較少的雌花序和雄花序10YMMo-102種類型;雄花序∶雌花序=2∶811YMMo-112種類型;雄花序∶雌花序=7∶312YMMo-124種類型;較多的混合花序和兩性花,較少的雌花序和雄花序13YMMo-132種類型;雄花序∶雌花序=3∶714YMMo-144種類型;較多的雌花序和雄花序,較少的混合花序和兩性花15YMMo-152種類型;雄花序∶雌花序=1∶916YMMo-162種類型;較多的雄花序和非常少的雌花序17YMMo-172種類型;雄花序∶雌花序=6∶418YMMo-182種類型;雄花序∶雌花序=6∶419YMMo-192種類型;雄花序∶雌花序=1∶120YMMo-204種類型;較多的雌花序和兩性花,較少的雄花序和混合花序21YMMo-212種類型;較多的雄花序和非常少的雌花序22YMMo-223種類型;較多的雌花序和兩性花,較少的雄花序23YXMo-13種類型;較多的雄花序和兩性花,較少的混合花序24YXMo-22種類型;雄花序∶雌花序=1∶125YXMo-33種類型;雄花序∶雌花序∶兩性花=1∶1∶126YXMo-42種類型;雄花序∶雌花序=4∶627YXMo-52種類型;較多的雌花序和非常少的雄花序28YXMo-64種類型;較多的雄花序和混合花序,較少的雌花序和兩性花29YXMo-73種類型;較多的兩性花,較少的雌花序和雄花序30YXMo-82種類型;雄花序∶雌花序=7∶331YXMo-94種類型;較多的雌花序和兩性花,較少的雄花序和混合花序32YXMo-104種類型;較多的雄花序和混合花序,較少的雌花序和兩性花33YXMo-114種類型;較多的雄花序和兩性花,較少的雌花序和混合花序

注：Mo為雌雄同株樹。

M.50 bp DNA Ladder；A.雌花序；B.雄花序；C.混合花序；D.兩性花。

圖1 引物對(duì)ptms-7測(cè)定的9棵雌雄同株黃連木及每棵雌雄同株樹不同性別類型花序的SSR等位基因

2.3 SSR標(biāo)記的聚類分析

利用基于Nei’s遺傳距離數(shù)據(jù)矩陣的UPGMA方法構(gòu)建了4個(gè)黃連木地區(qū)的聚類圖。為了更清楚的分析黃連木不同個(gè)體之間的親緣關(guān)系，根據(jù)聚類結(jié)果選擇一個(gè)較大的遺傳相關(guān)系數(shù)作為閾值。

表4 河北老姑和楊家庵地區(qū)37個(gè)雌雄同株樣本花序類型和分布

注：Mo為雌雄同株樹。

圖2以遺傳相關(guān)系數(shù)0.86為閾值，河南馬鞍山和西齊地區(qū)63個(gè)黃連木樣本的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：YMMo-6和YMM-7的遺傳相似性系數(shù)最大，親緣關(guān)系最近，YXMo-9和YMF-6、YMMo-1和YMM-10、YMMo-20和YMMo-22、YMMo-11和YMF-4、YMMo-13和YMMo-16的親緣關(guān)系逐漸變遠(yuǎn)，而YMMo-14和YMMo-17的遺傳相似性系數(shù)較小，說明這兩個(gè)個(gè)體在63個(gè)黃連木樣本中親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。在這7個(gè)聚類中，雌雄同株樹與雌雄同株樹、雌樹、雄樹樣本聚類數(shù)分別為3、2、2，聚類結(jié)果表明在河南馬鞍山和西齊地區(qū)不同性別類型的黃連木均表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。圖3以遺傳相關(guān)性系數(shù)0.81為閾值，河北老姑和楊家庵地區(qū)77個(gè)黃連木樣本的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：JLMo-11和JLF-30的遺傳相似性系數(shù)最大，親緣關(guān)系最近;JLMo-4和JLF-16、JLMo-16和JLMo-30、JLMo-29和JYF-3、JLMo-12和JYF-4、JLMo-32和JLF-13、JLMo-27和JLF-29、JLMo-15和JLMo-26、JLMo-8和JLMo-24、JLMo-10和JLF-2的親緣關(guān)系逐漸變遠(yuǎn)，而JLMo-20和JLF-8的遺傳相似性系數(shù)較小，說明這兩個(gè)個(gè)體在77個(gè)黃連木樣本中親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。在這11個(gè)聚類中，雌雄同株樹與雌雄同株樹、雌樹樣本聚類數(shù)分別為3、8，聚類結(jié)果表明在河北老姑和楊家庵地區(qū)雌雄同株黃連木與雌雄同株樹、雌樹表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

河南和河北4個(gè)地區(qū)140個(gè)黃連木樣本的UPGMA聚類分析見圖4。以遺傳相關(guān)性系數(shù)0.86為閾值，140個(gè)黃連木樣本的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：JLMo-11和JLF-30的遺傳相似性系數(shù)最大，親緣關(guān)系最近；JYMo-4和JLF-21、JLMo-4和JLF-16、YMMo-6和YMM-7、YMMo-16和JLMo-22、YXMo-9和YMF-6、YMMo-1和YMM-10、YMMo-13和JLMo-26、JLMo-24和JYMo-2、YMMo-20和YMMo-22、JLMo-16和JLF-24、JLMo-29和JYF-3、YMMo-14和YMMo-17、YMMo-11和YMF-4的親緣關(guān)系逐漸變遠(yuǎn)，而JLMo-27和JLMo-30的遺傳相似性系數(shù)較小，說明這兩個(gè)個(gè)體在140個(gè)黃連木樣本中親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。在這15個(gè)聚類中，雌雄同株樹與雌雄同株樹、雌樹、雄樹樣本聚類數(shù)分別為6、7、2，聚類結(jié)果表明雌雄同株黃連木與雌雄同株樹、雌樹與雄樹均表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。雌雄同株樹不僅可以和當(dāng)?shù)氐狞S連木聚類，也可以與其他地區(qū)的黃連木聚類。

3 結(jié)論與討論

太行山區(qū)是我國黃連木主要分布區(qū)[22]。近些年在河南林州和河北唐縣分別發(fā)現(xiàn)了7棵、23棵雌雄同株黃連木[10-11]，改變了黃連木屬雌雄異株的觀點(diǎn)。中國黃連木親緣關(guān)系的研究主要集中在對(duì)黃連木不同居群或不同種源親緣關(guān)系[18，23-24]，并未涉及雌雄同株黃連木。

黃連木屬植物的遺傳關(guān)系與地理位置與環(huán)境因素密切相關(guān)[18，23，25-27]，如郝麗娟[23]基于SSR分子標(biāo)記對(duì)中國黃連木地區(qū)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)相鄰省份的黃連木居群具有較近的親緣關(guān)系。吳志莊等[18]對(duì)11個(gè)黃連木群體的18個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)來源地較近的群體親緣關(guān)系較為密切，而來源地不同的群體遺傳差異相對(duì)較大。但在本研究中，黃連木的親緣關(guān)系與來源地?zé)o明顯的相關(guān)性和地域性，如河南和河北4個(gè)地區(qū)的黃連木均表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，分析其差異可能源于本研究的4個(gè)地區(qū)，同屬太行山東麓，地域相近，空間距離小(可能屬同一起源)，較為集中且跨度較小。

圖2 河南馬鞍山和西齊地區(qū)63個(gè)樣本的聚類分析樹狀圖

圖3 河北老姑和楊家庵地區(qū)77個(gè)樣本的聚類分析樹狀圖

圖4 河南和河北四個(gè)地區(qū)140個(gè)樣本的聚類分析樹狀圖

在河北兩個(gè)黃連木地區(qū)，雌雄同株與雌樹表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，與雄樹的親緣關(guān)系有待進(jìn)一步確定。在調(diào)查種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)，雄樹黃連木的樹齡較小，大約為20 a，均為實(shí)生樹，可能是雄樹黃連木被當(dāng)?shù)厝舜罅靠撤ピ斐?。在河南兩個(gè)黃連木地區(qū)，3種性別類型均表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。這些結(jié)果可能是由于河南和河北4個(gè)地區(qū)黃連木雌雄同株樹、雌樹和雄樹具有共同的起源，也可能是由于雌雄同株黃連木可以與當(dāng)?shù)氐拇茦浠蛐蹣浒l(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

BAI, et al.[21]發(fā)現(xiàn)雌雄同株黃連木的性別表現(xiàn)是不穩(wěn)定的，除了沒有雌花變成雄花外，雌花序、雄花序、混合花序或兩性花在連續(xù)的1 a內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成其他性別類型。但在河南省進(jìn)行種質(zhì)資源調(diào)查時(shí)，許多當(dāng)?shù)厝吮硎居写茦渥兂尚蹣涞那闆r出現(xiàn)，對(duì)此還需要進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)同一棵雌雄同株樹上不同性別類型花序的DNA條帶沒有差異，說明性別類型在同一株樹上的可變表達(dá)不是DNA變異造成的，而是基因表達(dá)調(diào)控引起的發(fā)育結(jié)果。因此今后的性別穩(wěn)定性研究工作應(yīng)從表型水平進(jìn)行。