周夢琪，范琪琪，孫 瑤

（同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072）

骨骼肌是一種含水量極高的彈性結(jié)締組織，在機(jī)體中發(fā)揮力量傳遞及結(jié)構(gòu)支持的作用。骨骼肌損傷是運(yùn)動和生活中最常見的創(chuàng)傷之一，損傷后骨骼肌需要經(jīng)歷自我修復(fù)再生［1］。骨骼肌的損傷和再生是一個連續(xù)病理過程的不同階段，包括：骨骼肌的變性壞死，肌纖維結(jié)構(gòu)破壞；炎性細(xì)胞浸潤；骨骼肌干細(xì)胞激活；再生肌纖維的分化成熟，直至肌功能恢復(fù)。骨骼肌的修復(fù)依賴多種肌再生因子發(fā)揮作用［2］。隨著年齡的增長，由于骨骼肌干細(xì)胞數(shù)量及微環(huán)境的改變，骨骼肌修復(fù)能力顯著減退［3］。

近年來，蛋白聚糖（proteoglycan，PG）在組織的發(fā)育與再生中的作用受到廣泛關(guān)注。近期有研究表明，多種蛋白聚糖在骨骼肌中隨著年齡的增長表達(dá)降低，并通過調(diào)控細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)骨骼肌微環(huán)境影響骨骼肌再生［4?6］。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（glycosyla?tion of dentin matrix protein 1，DMP1）是一種酸性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其蛋白質(zhì)N 端（DMP1?N）經(jīng)過糖基化修飾形成蛋白聚糖形式的分子 DMP1?PG［7］。DMP1?PG 在軟骨和類骨質(zhì)中高度表達(dá)，并在骨發(fā)育和骨改建中發(fā)揮重要作用［8］，缺乏 DMP1?PG 的骨組織呈現(xiàn)老齡骨的特征［9］，并且影響骨折愈合［10］。近期研究發(fā)現(xiàn)在骨骼肌中存在大量DMP1?PG。然而關(guān)于DMP1?PG 在骨骼肌中增齡性變化和損傷修復(fù)中的作用無相關(guān)報(bào)道。本研究構(gòu)建了DMP1 糖基化位點(diǎn)突變（DMP1?S89G）的小鼠，造成小鼠體內(nèi)缺乏DMP1?PG，通過骨骼肌損傷模型探究 DMP1?PG 對小鼠骨骼肌損傷修復(fù)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

DMP1?S89G 小鼠由課題組前期設(shè)計(jì)并委托北京奧賽圖生物基因技術(shù)有限公司構(gòu)建。前期研究發(fā)現(xiàn)氨基酸S89是小鼠DMP1 主要的糖基化位點(diǎn)，據(jù)此采用基因敲入技術(shù)將DMP1 的絲氨酸89 替換為甘氨酸89，以干擾DMP1 的正常糖基化過程。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明S89?G89 明顯減少DMP1 糖基化水平。年輕（5 周齡）及老齡（12月齡）WT 小鼠購于上海南方模式生物有限公司。所有實(shí)驗(yàn)動物在12 h光照／12 h 黑暗循環(huán)下在SPF 設(shè)施中飼養(yǎng)。對小鼠進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)方案均由同濟(jì)大學(xué)動物倫理委員會（TJLAC?017?027）批準(zhǔn)。

1.2 腓腸肌冰凍損傷模型

按照文獻(xiàn)［11］報(bào)道方法建立小鼠腓腸肌冰凍損傷模型。使用 5 周齡雄性 WT 小鼠和 DMP1?S89G 小鼠建立冰凍損傷模型。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）后，對手術(shù)區(qū)皮膚進(jìn)行消毒，沿脛骨后側(cè)做2 cm 皮膚切口，暴露腓腸肌。將在液氮中冷卻15 s 的金屬棒置于暴露的腓腸肌表面凍融3 個循環(huán)，用4?0 絲線縫合皮膚，并將小鼠置于37 ℃的恒溫墊上2 h。

1.3 H?E染色

在冰凍損傷后2、7、14 d 及 1 個月，將小鼠麻醉處死后取傷側(cè)腓腸肌，將腓腸肌放在4%多聚甲醛中于4 ℃放置24 h 后，通過梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中。對組織切片，每個切片 4 μm 厚。將切片脫蠟和再水化后，進(jìn)行H?E 染色。

1.4 免疫熒光染色

對切片進(jìn)行抗原修復(fù)并用山羊血清封閉處理。將切片與 anti?DMP1?N?9B6.3（1 ∶500；美國貝勒牙學(xué)院秦春林教授贈予）一起孵育，在4 ℃環(huán)境過夜。然后用PBS 洗滌，將切片與用熒光標(biāo)記的二抗室溫敷育1 h 用DAPI 對切片進(jìn)行復(fù)染色，封片后用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse 80i，日本尼康公司）觀察。

1.5 RT?qPCR實(shí)驗(yàn)

冰凍損傷后2、7、14 d，取冰凍損傷鼠傷側(cè)腓腸肌，使用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit（瑞士Roche 公司）反轉(zhuǎn)錄提取 RNA。然后，使用FastStart Essential DNA Green Master Kit （ 瑞 士Roche 公司）和 Light Cycler 96 Instrument 系統(tǒng)（瑞士Roche 公司）分析靶基因的相對mRNA 表達(dá)。引物購自生物工程（上海）股份有限公司，引物序列列于表1。GAPDH 用作每個基因的內(nèi)源對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用多個獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和多因素方差分析來驗(yàn)證各組評價參數(shù)的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Real?time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for real?time PCR

2 結(jié) 果

2.1 DMP1?PG在小鼠骨骼肌中的表達(dá)

DMP1?PG 是 DMP1 蛋白 N 端的糖基化形式，通過免疫熒光染色，用抗DMP1?N 端抗體觀察DMP1?PG 的表達(dá)，DMP1?PG 在腓腸肌纖維連接處廣泛表達(dá)（圖1A、B）。此外，與 5 周齡 WT 小鼠相比，12月齡WT 小鼠肌纖維連接處觀察到少量DMP1?PG（圖1C、D）。RT?qPCR 結(jié)果顯示，5 周齡 WT 小鼠腓腸肌DMP1?PG 相對表達(dá)量為（0.012 3±0.004 5），顯著高于12月齡小鼠腓腸肌的（0.000 5±0.000 2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 DMP1?PG在小鼠骨骼肌損傷修復(fù)過程中的表達(dá)

為了觀察DMP1?PG 在小鼠骨骼肌再生過程中的表達(dá)，建立了WT 小鼠腓腸肌的冰凍損傷模型。在小鼠腓腸肌損傷修復(fù)過程中，評估 DMP1?PG mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在腓腸肌損傷后2 d，DMP1?PG 表達(dá)有下降趨勢（P＜0.01）；損傷后 7 d，DMP1?PG 表達(dá)量顯著上調(diào) （P＜ 0.001）；損傷后14 d，DMP1?PG 表達(dá)量下降至正常水平（圖2）。

圖1 DMP1?PG 在小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.1 Expression of DMP1?PG in mouse skeletal muscle

圖2 DMP1?PG 在小鼠骨骼肌損傷后不同時間點(diǎn)的表達(dá)Fig.2 Expression of DMP1?PG at different time points after mouse skeletal muscle injury

2.3 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌損傷修復(fù)

為了進(jìn)一步探究DMP1?PG 在小鼠骨骼肌損傷修復(fù)中的作用，對 5 周齡 WT 小鼠和 DMP1?S89G小鼠建立冰凍損傷模型，分別于損傷后2、7、14、30 d收取損傷腓腸肌。H?E 染色顯示，損傷后 2 d，WT小鼠損傷處肌纖維腫脹壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，DMP1?S89G 小鼠炎性細(xì)胞浸潤較少；骨骼肌損傷后7 d，WT 小鼠損傷處出現(xiàn)大量中央成核肌纖維；損傷后14 d，出現(xiàn)大量多核肌纖維融合形成的肌管，DMP1?S89G 小鼠損傷后7 d 中央成核肌纖維形成較少，損傷后14 d 多數(shù)肌纖維仍處于融合狀態(tài)；損傷后1 個月，WT 小鼠損傷處出現(xiàn)大量成熟肌纖維，DMP1?S89G 組成熟肌纖維較少。說明在冰凍損傷后，在WT 野生型小鼠中，骨骼肌能夠較快的修復(fù)，但是在缺乏DMP1?PG 的小鼠模型中，肌肉損傷修復(fù)的速度減緩，呈現(xiàn)明顯修復(fù)不良（圖3）。

圖3 損傷后不同時間點(diǎn)小鼠骨骼肌H?E 染色Fig.3 Histological characterization of mouse skeletal muscle using H?E staining （Scale bar＝100 μm）

2.4 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌再生相關(guān)因子的表達(dá)

為探究DMP1?PG 影響小鼠骨骼肌損傷修復(fù)的機(jī)制，使用 RT?qPCR 測定損傷后 2、7、14 d 小鼠腓腸肌肌再生相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，損傷后2 d，MyoD mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)，而 DMP1?S89G小鼠MyoD mRNA 表達(dá)量顯著低于WT 小鼠（P＜0.000 1），見圖4A。HGF 和 Myf5 mRNA 表達(dá)相似，損傷后2、7、14 d 其表達(dá)量顯著增加；在損傷后2 d，DMP1?S89G 小鼠 HGF 和 Myf5 mRNA 表達(dá)量顯著低于 WT 小鼠（P＜0.01），見圖4C、E。Myoge?nin mRNA 表達(dá)量在損傷后 2、7、14 d 顯著上調(diào)，且在損傷后 2、7 d，DMP1?S89G 小鼠的表達(dá)量均顯著低于 WT 小鼠（P＜0.000 1），見圖4B。損傷后 2、7 d，MGF 表達(dá)量顯著上調(diào)，而損傷后 7 d DMP1?S89G 小鼠的表達(dá)量顯著低于 WT 小鼠（P＜0.001），見圖4D。在損傷后 2、7、14 d，Myosatin mRNA 表達(dá)量顯著下調(diào)，但在 DMP1?S89G 小鼠和 WT 小鼠中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4F。

圖4 DMP1?PG 缺失對損傷后小鼠骨骼肌再生因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of reduced DMP1?PG on the expression of regeneration factors in mouse skeletal muscle after injury

2.5 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌血管再生相關(guān)因子的表達(dá)

RT?qPCR 檢測結(jié)果顯示，DMP1?PG 糖基化減少會顯著抑制小鼠腓腸肌損傷后2 d VEGF mRNA的表達(dá)（P＜0.01），見圖5A；而 HIF?1α mRNA 的表達(dá)在損傷后2 d 顯著上調(diào)（P＜0.000 1），見圖5B；損傷后 2、7、14 d，Angpt1 mRNA 的表達(dá)在 DMP1?S89G 組顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖5C。

圖5 DMP1?PG 減少對損傷后小鼠骨骼肌血管再生因子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of reduced DMP1?PG on the expression of angiogenesis factors in mouse skeletal muscle after injury

3 討 論

骨骼肌再生是一個受多種因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，其再生過程分為 3 個階段［12］。第 1 階段為損傷炎癥期，發(fā)生于損傷的早期，此時肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤。第2 階段為損傷修復(fù)期，出現(xiàn)在損傷后5 ～10 d，原本靜息狀態(tài)下的骨骼肌干細(xì)胞被激活，遷移、增殖、分化，與損傷的肌纖維融合以修復(fù)受損骨骼肌。第3 階段發(fā)生于損傷后14～21 d，此時再生的肌纖維成熟，稱為組織塑形期［1，13?14］。此過程受多種因素影響，其中存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的多種蛋白聚糖，在骨骼肌的發(fā)育和再生中的作用在近年來引起了關(guān)注。蛋白聚糖通過調(diào)控一些細(xì)胞因子，如 MGF［15］和 HGF［16?17］影響骨骼肌干細(xì)胞的活化、遷移和增殖，從而影響骨骼肌的發(fā)育、修復(fù)。隨著年齡的增長，骨骼肌中大多數(shù)蛋白聚糖表達(dá)減少，骨骼肌再生能力下降［18］。研究結(jié)果表明，表達(dá)多配體蛋白聚糖syndecan 的骨骼肌干細(xì)胞數(shù)量隨著年齡的增長而降低［19?20］。

DMP1 是一種在機(jī)體中廣泛分布的酸性蛋白，水解后斷裂成 DMP1?NH2端（簡稱 DMP1?N）和 DMP1?COOH 端（簡稱 DMP1?C）。DMP1?N 通過共價鍵連接一個糖胺聚糖鏈形成DMP1?PG，具有蛋白聚糖的特性，其在未礦化的類骨質(zhì)、前期牙本質(zhì)、軟骨基質(zhì)中大量表達(dá)，參與牙本質(zhì)和骨的礦化，調(diào)節(jié)骨改建，維持骨細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［21?22］。研究表明，老齡小鼠骨組織中 DMP1?PG 表達(dá)下降，DMP1?PG 減少會導(dǎo)致牙本質(zhì)變薄，骨組織骨量下降，骨脆性增加，呈現(xiàn)老齡骨特性［9］，并且 DMP1?PG 的缺乏會導(dǎo)致骨折愈合異常［10］。近年來的研究也發(fā)現(xiàn) DMP1?PG 在多種軟組織，如血腦屏障中表達(dá)，并發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。作為機(jī)體重要的軟組織，骨骼肌也有DMP1?PG 的表達(dá)，但DMP1?PG 在骨骼肌中的增齡性變化及對骨骼肌損傷修復(fù)的影響有待進(jìn)一步揭示。

在本研究中，首先檢測了 DMP1?N／DMP1?PG在小鼠骨骼肌中的增齡性表達(dá)變化，結(jié)果顯示DMP1?N／DMP1?PG 集中表達(dá)在年輕小鼠骨骼肌肌纖維連接處，而在老齡小鼠骨骼肌中表達(dá)顯著下降。為了進(jìn)一步探討DMP1?PG 是否會影響小鼠骨骼肌生成和維持，從而影響骨骼肌損傷修復(fù)，對年輕小鼠建立了經(jīng)典的骨骼肌損傷模型，并檢測有無DMP1?PG 對于骨骼肌的影響。利用RT?qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測冰凍損傷后不同修復(fù)時間點(diǎn)骨骼肌DMP1?PG mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，損傷后 2 d，DMP1?PG 表達(dá)有下降趨勢，這可能是由于損傷處肌肉組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞導(dǎo)致，而損傷后7 d 表達(dá)顯著上調(diào)，損傷后14 d DMP1?PG 表達(dá)恢復(fù)至正常水平。這些結(jié)果提示，DMP1?PG 參與小鼠骨骼肌損傷修復(fù)過程。氨基酸S89是小鼠DMP1 唯一的糖基化位點(diǎn)，并高度保守，據(jù)此本研究通過基因敲入技術(shù)將該位點(diǎn)的絲氨酸替換為甘氨酸，干擾DMP1 的糖基化過程，構(gòu)建了一種缺乏 DMP1?PG 的 DMP1?S89G 小鼠，H?E 結(jié)果顯示，與 WT 小鼠相比，DMP1?S89G 小鼠骨骼肌損傷后炎性細(xì)胞浸潤較少，損傷后7 d 中央成核的再生肌纖維形成減少，再生肌纖維融合、成熟過程滯后。本研究結(jié)果表明，DMP1?PG 缺失會抑制小鼠骨骼肌損傷后修復(fù)的關(guān)鍵過程。

肌肉組織是一種內(nèi)分泌器官，骨骼肌再生受到多種因子的調(diào)控［24］。骨骼肌再生受到肌源性調(diào)控因子（MRFs）MyoD、myogenin、Myf5 表達(dá)調(diào)控［25］。MyoD 和Myf5 協(xié)同作用使骨骼肌干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期并調(diào)控其分化，缺乏MyoD 會導(dǎo)致骨骼肌干細(xì)胞分化延遲，當(dāng)敲除MyoD 和Myf5 的基因后，增殖的干細(xì)胞無法進(jìn)一步分化［26］。Myogenin 也參與骨骼肌干細(xì)胞細(xì)胞分化，是干細(xì)胞分化標(biāo)志物［27］。同時骨骼肌干細(xì)胞的激活、增殖、活化還受到 Myostain 的負(fù)調(diào)控［28］。骨骼肌受損后，除了肌肉本身，血管、浸潤的炎性細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)也會釋放相關(guān)因子，誘導(dǎo)骨骼肌再生，包括成MGF 和HGF。本研究測定了上述因子在小鼠骨骼肌損傷修復(fù)過程中的表達(dá)，結(jié)果顯示骨骼肌損傷后多種MRF 表達(dá)顯著上調(diào)，參與骨骼肌損傷后修復(fù)；而當(dāng)DMP1?PG 缺失后，這些肌再生因子的表達(dá)則顯著下調(diào)。這說明DMP1?PG 缺失后小鼠骨骼肌損傷修復(fù)異常可能是由于肌再生因子表達(dá)受到抑制。此外，血管再生也是骨骼肌損傷后修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，新生的血管可為骨骼肌再生提供營養(yǎng)和氧氣，并且維持骨骼肌所處環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［29?30］。有研究表明 HIF?1α、Angpt1 和VEGF 可直接參與骨骼肌損傷修復(fù)［31?33］。本研究結(jié)果顯示，DMP1?PG 缺失后在小鼠骨骼肌損傷修復(fù)過程中 VEGF 表達(dá)下降，HIF?1α、Angpt1 表達(dá)上升，說明損傷處新生血管較少，損傷處缺氧狀態(tài)改善不足，提示DMP1?PG 缺失后損傷小鼠骨骼肌的血管再生受到抑制，進(jìn)而抑制骨骼肌再生。

綜上，本研究結(jié)果表明DMP1?PG 在小鼠骨骼肌中增齡性減少，并參與了小鼠骨骼肌損傷修復(fù)過程。冰凍損傷后，在缺乏DMP1?PG 的小鼠模型中，肌肉損傷修復(fù)的速度減緩，修復(fù)成度明顯不良，且這種抑制作用可能與DMP1?PG 缺失導(dǎo)致的肌再生相關(guān)因子和血管再生因子表達(dá)異常有關(guān)。但是當(dāng)DMP1?PG 恢復(fù)至正常水平后，小鼠骨骼肌損傷后修復(fù)能力是否能恢復(fù)正常，DMP1?PG 在肌肉再生和肌肉干細(xì)胞分化過程中的作用還需要進(jìn)一步探討。