蘇春曉，白靜慧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032)

欖香烯(β-Elemene)是一種從姜黃(CurcumazedoariaRoscoe)中提取的倍半萜烯化合物，一般用于中藥(TCM)治療，可通過調(diào)節(jié)不同的通路治療肺癌在內(nèi)的多種腫瘤，包括肝癌、乳腺癌、胃癌等[2]。有文獻(xiàn)[1]詳細(xì)總結(jié)了欖香烯在中藥抗腫瘤方面的重要作用，而近年來關(guān)于欖香烯的研究也進(jìn)一步證實(shí)了欖香烯的抗癌作用，如近期某項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯在腫瘤的傳統(tǒng)聯(lián)合治療中，具有增敏靶向治療的作用，可增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)靶向藥物的吸收[3]。但是目前，對(duì)于欖香烯用藥的確切濃度以及最佳時(shí)間的選擇仍然比較模糊。本研究通過觀察β-欖香烯作用于人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響，探討β-欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的作用機(jī)制，進(jìn)而分析欖香烯作用于A549細(xì)胞系時(shí)的最適濃度以及時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

本研究所用人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株，由遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥材和試劑

欖香烯(購于上海復(fù)祥生物科技有限公司)；1640完全培養(yǎng)液(購于 HyClone公司)，加入10%胎牛血清(購于上海逸研生物科技有限公司)；5%雙抗(青霉素和鏈霉素)購于 HyClone公司；PBS購于 HyClone公司；胰蛋白酶消化液購于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑購于中國(guó)碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于中國(guó)碧云天生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取實(shí)驗(yàn)用人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、5%雙抗的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將細(xì)胞放入環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)，1～2天換1次液，2～3天傳代1次。以上實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

2.2 欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增值的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白組(只加1640完全培養(yǎng)液)和對(duì)照組(加入完全培養(yǎng)液)。濃度為10、20、40、80、160 μg/mL各1組，每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞接種于96孔板中(每孔7×103個(gè)細(xì)胞)，過夜后吸除培養(yǎng)液。空白組和對(duì)照組分別加入1640完全培養(yǎng)基，其余各組分別加入濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的欖香烯藥液，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，吸除培養(yǎng)液和藥液后，每孔加入0.1 mL CCK-8試劑，避光，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔D(450)值，觀察空白組以便于排除因其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，后按公式：細(xì)胞抑制率(%)=[D(450)對(duì)照組-D(450)實(shí)驗(yàn)組]/D(450)對(duì)照組×100%，計(jì)算細(xì)胞抑制率。使用SPSS軟件，計(jì)算IC50。

2.3 欖香烯對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組和濃度為 10、20、40、80、160 μg/m的各一組，共6組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪于孔板中，培養(yǎng) 24 h后，分別加入濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的欖香烯藥液，放置于環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中，48 h后取出，分別用膠頭滴管吸取上清液于1.5 mL的EP管中，4 ℃離心，使細(xì)胞沉到管底，吸取上清液并丟棄，可留50 μL培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。加入1 mL提前遇冷的PBS，重懸細(xì)胞，移到1.5 mL無菌離心管，4 ℃離心，使細(xì)胞沉底。小心吸取上清液并丟棄，可留50 μL PBS，以免吸走細(xì)胞。輕彈離心管以分散細(xì)胞，避免成團(tuán)。細(xì)胞固定：加入1 mL冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定2 h(12～24 h效果更佳)。細(xì)胞清洗：4 ℃離心，使細(xì)胞沉到管底。吸取上清液并丟棄，留50 μL溶液，以免吸走細(xì)胞。加入1 mL提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，移到1.5 mL無菌離心管。4 ℃離心，使細(xì)胞沉底。吸取上清液并丟棄，可留50 μL PBS，以免吸走細(xì)胞。PI染色：在每個(gè)細(xì)胞樣品中加入500 μL配置好的PI工作液，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，置于37 ℃避光水浴30 min。檢測(cè)分析：用流式細(xì)胞儀在488 nm條件下檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 欖香烯對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞周期的影響

采用碘化丙啶(PI)標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：將人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞接種于24孔板，分組及藥物處理同“2.2”項(xiàng)，在環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)24 h，吸出上清液，用胰酶將細(xì)胞消化吹打，制成細(xì)胞懸液，用膠頭滴管移至EP管，以2 000 r/min、20 ℃，離心10 min，用4 ℃預(yù)冷后的75%乙醇固定，4 ℃避光過夜。次日取出，以2 000 r、20 ℃，離心10 min，清洗2次(第一次用PBS，第二次用染色液)。將細(xì)胞重懸于0.5 mL PI染色液中，4 ℃避光染色 30 min。采用流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞各周期的百分率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 β-欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)CCK-8法檢測(cè)，SPSS分析可知：欖香烯作用于A549細(xì)胞48 h與72 h的IC50分別為167.40 μg/mL和104 μg/mL。

在作用時(shí)間為24 h、48 h、72 h的條件下，人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的抑制率，隨濃度在10～160 μg/mL范圍內(nèi)的β欖香烯的作用呈濃度性依賴，且每個(gè)時(shí)間段均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不過在10～20 μg/mL濃度段無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他濃度段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1、圖1。

組別24h48h72h10μg/mL5.04±0.1212.56±0.7017.87±0.8520μg/mL6.66±0.4216.49±0.6321.50±0.9740μg/mL7.69±0.4220.65±1.3030.72±0.7680μg/mL25.31±0.5733.33±1.3640.30±0.19160μg/mL43.45±0.5653.45±1.1663.05±1.33

圖1 欖香烯對(duì)A549細(xì)胞增值的抑制作用

3.2 β-欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞周期的影響

經(jīng)分析，G2/M期各濃度與對(duì)照組相比，只有40 μg/mL與80 μg/mL具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與24 h相比，48 h及72 h的G2/M期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)，sub-G1期明顯上升；與對(duì)照組比較，只有40 μg/mL與80 μg/mL具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與24 h相比，48 h和72 h均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但48 h與72 h之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖2。

3.3 β-欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，濃度為10 μg/mL和濃度為20 μg/mL的組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。組間比較，24 h、48 h、72 h間亦均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞凋亡率隨欖香烯作用濃度的增高亦有升高趨勢(shì)。見表3、圖3。

組別周期24h48h72h0μg/mLG2/M期15.60±0.3515.67±0.4515.43±0.39Sub-G1期0.78±0.080.72±0.020.77±0.0310μg /mLG2/M期15.74±0.2012.66±0.4412.43±0.47Sub-G1期0.72±0.051.55±0.061.65±0.0620μg/mLG2/M期15.27±0.2012.32±0.5011.97±0.58Sub-G1期0.76±0.052.29±0.462.35±0.7240μg/mLG2/M期15.86±0.297.77±0.577.64±0.39Sub-G1期0.73±0.044.71±0.465.41±0.3580μg/mLG2/M期15.67±0.517.50±0.436.59±0.54Sub-G1期0.73±0.026.32±0.497.33±0.43160μg/mLG2/M期15.68±0.2612.38±0.5310.44±0.48Sub-G1期0.67±0.022.45±0.522.72±0.48

圖2 欖香烯對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

組別24h48h72h0μg/mL0.15±0.050.18±0.020.19±0.0210μg/mL1.11±0.303.37±1.508.54±1.1620μg/mL1.44±0.554.70±1.6710.65±1.4240μg/mL1.43±0.659.50±1.9416.54±2.2480μg/mL3.78±1.2017.09±2.2422.74±2.38160μg/mL7.20±1.6219.04±2.8031.26±3.00

圖3 欖香烯對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，約占全部癌癥患者的11.6%，同時(shí)也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，約占全部癌癥死亡病例的18.4%[4]。70%以上的患者在首次診斷為肺癌時(shí)就已經(jīng)是晚期，肺癌的5年生存率不足20%[5]。臨床上，肺癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，手術(shù)是治療肺癌的主要方式，術(shù)后患者需要接受常規(guī)化療治療，化療通常伴隨較為嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，如納呆、惡心嘔吐、情緒焦躁、便秘等，給患者生理、心理造成很大程度的傷害[6]。欖香烯是國(guó)家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，由中藥溫郁金提煉而來，在臨床上廣泛應(yīng)用于癌癥的治療[7]。欖香烯不僅可以提高癌癥的臨床療效，還能增強(qiáng)患者的細(xì)胞免疫功能，減輕化療的毒副作用[8]。故欖香烯在臨床治療癌癥中有重要作用，需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于其深層次的研究，以造福患者。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過探究欖香烯對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的作用機(jī)制，進(jìn)一步明確了欖香烯作用于細(xì)胞的相對(duì)有效時(shí)間與最佳作用濃度，為今后非小細(xì)胞肺癌患者的臨床用藥提供了有益借鑒。