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      SMYD2對心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成的影響

      2020-05-15 07:17:10孫雪林張亞同陳頔朱愿超梁良趙紫楠胡欣
      中國心血管雜志 2020年2期
      關(guān)鍵詞:膠原甲基化纖維化

      孫雪林 張亞同 陳頔 朱愿超 梁良 趙紫楠 胡欣

      100730 北京醫(yī)院藥學(xué)部 國家老年醫(yī)學(xué)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院

      心肌纖維化是以心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts, CFs)過度增殖、膠原異常沉積分布為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)[1]。心肌纖維化是多種心臟疾病的共同特征,可使心肌間質(zhì)沉積大量膠原,導(dǎo)致心室壁順應(yīng)性下降,引起心肌收縮力減弱,冠脈血流儲備降低。心肌纖維化長期發(fā)展易導(dǎo)致心肌缺血復(fù)發(fā)、心力衰竭和猝死[2]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2(SET and MYND domain-containing protein 2)屬于SMYD家族成員,主要通過甲基化組蛋白和非組蛋白賴氨酸發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用[3-4]。近年研究證實SMYD家族在心臟中發(fā)揮了重要作用[5]。目前關(guān)于SMYD2在心肌纖維化中作用尚未見報道,本實驗通過研究SMYD2對CFs增殖和膠原合成的影響,探討SMYD2參與心肌纖維化發(fā)生的分子機制。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      1.1.1 實驗對象 原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠(≤3 d)原代CFs。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006。

      1.1.2 構(gòu)建SMYD2-siRNA 大鼠SMYD2的siRNA應(yīng)用pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成),針對SMYD2的序列,設(shè)計了3個干擾序列,如下:SMYD2-RNAi-1#,CCGTCTCTAGTGCCAACTTTA-CTCGAG-TAAAGTTGGCACTAGAGACGG;SMYD2-RNAi-2#,GCGGAGACAGATCAACTTGAA-CTCGAG-TTCAAGTTGATCTGTCTCCGC;SMYD2-RNAi-3#,CCTGTCAACACACAGGACTTT-CTCGAG-AAAGTCCTGTGTGTTGACAGG。pGCsi.U6/neo/GFP control-siRNA質(zhì)粒作為對照,對照序列如下:5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAA-CGTGACACGTTCGGAGAA-3’。

      1.1.3 試劑 改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/High Glucose1×, DMEM/Low Glucose1(SH30021.01B-240-NWF0419, Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(SV30087.01B-2213-NUC0153, Hyclone, Thermo scientific公司);胰酶細(xì)胞消化液(C0201, Beyotime公司);EDTA.Na.2H2O(0105-100g, Amresco公司);2.5% Trypsin 10×100 ml(15090-046, GIBCO, Invitrogen公司);青霉素和鏈霉素溶液100× 100 ml(C0222, Beyotime公司);溴脫氧尿苷(BrdU,Sigma公司);血管緊張素Ⅱ(AngⅡ, Sigma公司); 牛血清白蛋白(BSA) 5 g(Roche, 738238, 上海華舜生物工程有限公司); 漢克平衡鹽溶液1×(HBSS)(14170, GIBCO, Invitrogen公司);膠原酶COLLAGENASE type2 360 U/mg (4176, Worhtington Biochemical Corporation公司);牛血清白蛋白Albumin bovine(735094-100g, Roche公司);SMYD2(SAB2103606-100UL,SIGMA-ALDRICH公司);轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(sc-146, Santa Cruz Biotechnology公司)。

      1.1.4 PCR引物序列(表1)

      表1 PCR引物序列

      1.2 方法

      1.2.1 CFs培養(yǎng) 取1~3 d齡的Wistar乳鼠,無菌條件下取出心臟,轉(zhuǎn)入預(yù)冷DMEM中,將心臟剪碎成大小一致的組織塊。移至50 ml無菌離心管中,加入10 ml消化液, 37℃在搖床消化10 min,重復(fù)上述步驟,37℃消化10 min,渦旋10 s,在上清液中加入等體積的DMEM 含血清培養(yǎng)基終止消化,4℃保存。將所收集的液體用200目的濾網(wǎng)過濾,2 500 r/min離心3 min,棄上清液,加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液,吹打均勻后放入20 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于5% CO237℃孵箱中培育,2 h后心肌細(xì)胞貼壁,將含有CFs的上清轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

      1.2.2 Western Blot 將所提取的細(xì)胞總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,用濕轉(zhuǎn)法將凝膠電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。置于含5%封閉蛋白干粉的PBS溶液中,4℃封閉過夜。然后用PBS沖洗膜表面殘留蛋白封閉液,根據(jù)實驗?zāi)康?,分別加入克隆抗體(SMYD2、TGF-β1)室溫孵育NC膜12 h后,使用含0.05% Tween-20的PBS緩沖液沖洗NC膜。使用紅外熒光標(biāo)記抗體避光孵育NC膜1 h,以含0.05% Tween-20的PBS緩沖液沖洗NC膜,最后再用PBS沖洗,以降低背景。Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描分析。

      1.2.3 qPCR 利用TRIZOL提取細(xì)胞RNA,加入20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水,溶解RNA沉淀。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)體系和條件參照試劑說明書,產(chǎn)物于-20℃保存。采用SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒操作。SYBR Green Mix 10 μl,檢測上/下游引物各1 μl,cDNA 1 μl,Nuclease-Free補足體積至20 μl。反應(yīng)條件:95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共40 個循環(huán),以β-actin為內(nèi)參照。

      1.2.4 MTT法 用胰蛋白酶將培養(yǎng)的CFs消化為單個懸浮細(xì)胞,加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μl培養(yǎng)液,含有細(xì)胞數(shù)大約為103~104,在CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。加入AngⅡ和SMYD2-siRNA處理后,培養(yǎng)2~4 d,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),37℃孵育4 h后,將培養(yǎng)板取出,棄掉培養(yǎng)板內(nèi)液體,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),室溫震蕩10 min,溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選定490 nm波長測定各孔吸光度值,記錄實驗結(jié)果。以時間為橫軸,光吸收值為縱軸描繪細(xì)胞增殖情況。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

      2 結(jié)果

      2.1 AngⅡ促進CFs中SMYD2的表達(dá)

      通過酶消化法和差速貼壁的方法將心肌細(xì)胞和CFs分離,分別給予AngⅡ (50 nM和100 nM)作用48 h后,Western Blot檢測SMYD2蛋白的表達(dá)水平,qPCR檢測SMYD2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示AngⅡ促進SMYD2在蛋白和mRNA水平的表達(dá),并且呈劑量依賴性(圖1),提示SMYD2可能參與了CFs的體外增殖過程。

      2.2 降低SMYD2的表達(dá)可抑制CFs增殖和膠原合成

      給予AngⅡ(100 nM)作用后,CFs明顯增殖,SMYD2-siRNA則可抑制AngⅡ引起的細(xì)胞增殖(圖2)。qPCR檢測各組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá),AngⅡ(100 nM)可促進其合成和分泌,SMYD2-siRNA則降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)(圖3)。

      與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01(n=4)圖1 AngⅡ促進大鼠CFs中SMYD2蛋白和mRNA表達(dá)

      與對照組比較,aP<0.05;與SMYD2-siRNA組比較,bP<0.05(n=5)圖2 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs的增殖

      與對照組比較,aP<0.05;與SMYD2-siRNA組比較,bP<0.05(n=5)圖3 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs的膠原合成

      2.3 SMYD2對CFs增殖和膠原合成作用的分子機制

      在CFs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SMYD2-siRNA,結(jié)果顯示SMYD2-siRNA組TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)水平下降(圖4)。TGF-β1可促進CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成和分泌[6]。SMYD2可能通過影響TGF-β1的表達(dá)水平參與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成。

      與對照組比較,aP<0.05;與SMYD2-siRNA組比較,bP<0.05(n=5)圖4 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs中TGF-β1蛋白和mRNA水平

      3 討論

      本研究的結(jié)果表明,AngⅡ可促進體外培養(yǎng)CFs中SMYD2的表達(dá)增加,并呈劑量依賴性,因AngⅡ是CFs生長調(diào)節(jié)的重要生物因子,提示SMYD2可能參與CFs的增殖和膠原合成。CFs的過度增殖、膠原異常沉積分布導(dǎo)致心臟間質(zhì)重構(gòu),促進心肌纖維化的發(fā)生,因此SMYD2可能參與AngⅡ促進心肌纖維化發(fā)生的過程。實驗結(jié)果顯示,SMYD2能明顯增加CFs的增殖,以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原 mRNA的表達(dá);SMYD2-siRNA則可降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá),表明SMYD2參與了CFs膠原合成。TGF-β1作為CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成和分泌的重要調(diào)控因子,在CFs中過表達(dá)SMYD2 同樣促進TGF-β1蛋白和mRNA水平增加,SMYD2-siRNA可使其表達(dá)水平降低。

      AngⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生,主要機制是CFs的增殖和膠原蛋白的代謝紊亂及心肌細(xì)胞的肥大。AngⅡ可促進CFs向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并且分泌大量的膠原纖維和層粘蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)[7]。AngⅡ可以激活CFs細(xì)胞表面的L型和T型鈣通道,促進CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因表達(dá)增強。心肌纖維化是膠原合成和降解代謝失調(diào)的結(jié)果,與TGF-β1密切相關(guān)。TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化、促進細(xì)胞增殖等生物功能[8]。TGF-β1可誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的大鼠CFs分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白基因表達(dá)增加。因此,降低TGF-β1的表達(dá)可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原分泌,可作為心肌纖維化治療的一個重要靶點[9]。

      表觀遺傳學(xué)修飾異常廣泛存在于疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中,其中組蛋白甲基化修飾是研究中的熱點,組蛋白甲基化修飾酶參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)功能[10]。SMYD是含有SET結(jié)構(gòu)域和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白的家族,是一組重要的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,已證實現(xiàn)有SMYD1-5個家族成員,SMYD主要在胚胎發(fā)育、骨骼肌和心臟發(fā)育中發(fā)揮作用[11-13]。SMYD2對細(xì)胞增殖的影響不只是依賴于其對組蛋白甲基化的調(diào)控,更與SMYD2廣泛調(diào)節(jié)的非組蛋白底物相關(guān),包括p53、Rb1、PARP1、PTEN、Hsp90和ERα。SMYD2通過對這些底物的甲基化修飾調(diào)控這些蛋白的作用,從而發(fā)揮其生理和病理功能。SMYD2可將p53 的K371位點甲基化修飾,從而抑制其相鄰位點的SET7/9的甲基化。而K370位點甲基化是p53乙?;⒓せ钕掠位虮磉_(dá)的必要步驟,因此SMYD2抑制了p53的生物活性。SMYD2抑制了p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這可能是SMYD2參與腫瘤發(fā)生的重要機制之一[14]。SMYD2可催化Rb1的K810位點甲基化,該修飾促進了CDK4/CyclinD1復(fù)合體對Rb1的Ser807/811位點的磷酸化修飾,進而阻礙了Rb1與E2F的結(jié)合,促進E2F對下游基因的激活作用,促進細(xì)胞增殖[15]。SMYD2與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系尚未見報道。SMYD2主要在骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達(dá),對骨骼肌的成熟發(fā)揮重要作用,而在小鼠中的研究卻發(fā)現(xiàn)SMYD2對發(fā)育影響較小[16]。

      本研究主要證實了SMYD2在AngⅡ刺激的CFs細(xì)胞中表達(dá)增加,提示SMYD2參與CFs的增殖和膠原合成過程。降低SMYD2在CFs中的表達(dá)可明顯抑制CFs的增殖和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1的合成,證實SMYD2參與了AngⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生的病理過程。但SMYD2對心肌纖維化發(fā)生的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制需進一步深入研究。本研究僅在體外實驗證實SMYD2參與調(diào)控心肌纖維化的可能分子機制,尚缺乏體內(nèi)實驗的證據(jù),因此需要進一步的體內(nèi)實驗證實SMYD2對TGF-β1調(diào)控。此外,在心血管疾病臨床轉(zhuǎn)化研究中,SMYD2能否作為新型治療靶點也是今后研究的主要方向。

      利益沖突:無

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