張延鵬 都昌樂 楊寧

摘 要：本文以正交設(shè)計優(yōu)選金銀花總黃酮的超聲提取工藝。試驗以金銀花總黃酮為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，對料液比、超聲功率、超聲次數(shù)、乙醇濃度4個參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，以分光光度法測定金銀花總黃酮含量，得出最佳提取工藝參數(shù)。單因素考察結(jié)果顯示，超聲次數(shù)在120次、料液比為1∶40、超聲功率為120W、乙醇濃度為50%時，出現(xiàn)極值或最值。正交試驗結(jié)果表明：4因素對總黃酮提取率影響大小依次為超聲次數(shù)>料液比>乙醇濃度>超聲功率。由此可以得出，超聲提取金銀花總黃酮的最佳工藝條件為料液比為1∶30，超聲功率為120W，超聲次數(shù)為120次，乙醇濃度為50%。以超聲法提取金銀花總黃酮操作簡易，提取率高，適合工業(yè)生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：金銀花;總黃酮;超聲提取;正交設(shè)計

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430007

金銀花（Lonicera japonica Thunb），是忍冬科植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花[1]。因其能夠疏散風(fēng)熱、清熱解毒，故臨床常用于風(fēng)熱感冒、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥的治療，效果良好。金銀花含有黃酮類[2，3]、揮發(fā)油類[4]、有機(jī)酸類[5]等多種化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物具有保護(hù)心肌、降血壓、提高免疫功能、抗腫瘤等多重效用[6]。目前，對于金銀花總黃酮的研究也在不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)金銀花總黃酮在抑菌[7]、抗氧化[8]及保護(hù)肝臟[9，10]等方面效果良好，是金銀花的主要活性成分。金銀花總黃酮的提取方法較多，包括超臨界CO2萃取法[11]、超聲提取法[12]、溶劑提取法[13]、微波提取法[14]等，其中超聲提取法具有操作簡單、消耗時間少、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，節(jié)能環(huán)保，適合金銀花總黃酮的提取及其工業(yè)化生產(chǎn)。鑒于此，本文擬采用超聲法提取金銀花總黃酮，在單因素考察的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，以期得到最佳提取工藝，為金銀花總黃酮的高效提取利用及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫外-可見分光光度計（美國BECKMAN）;超聲破碎儀（江蘇天翎公司）;電熱恒溫水浴鍋（上海一恒公司）;萬分之一電子天平（天津智博聯(lián)公司）;恒溫干燥箱（上海益恒公司）;金銀花（亳州眾益堂中藥材公司，干燥備用）;蘆丁對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201811，供含量測定用）;氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、甲醇、乙醇等均為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁對照品儲備液的配制

精密稱取蘆丁對照品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入60%甲醇振蕩并水浴加熱溶解，再以60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到1μg/μL的蘆丁對照品儲備液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品儲備液150μL、200μL、250μL、350μL、450μL、550μL、650μL于10mL容量瓶中，各加水至1mL。再加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加4%氫氧化鈉溶液4mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。分別制成15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、35μg/mL、45μg/mL、55μg/mL、65μg/mL的蘆丁對照品溶液。以0μg/mL為空白對照液，于510nm波長處測定各濃度蘆丁對照品溶液的吸光度，以濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.3 總黃酮的提取及含量測定

稱取干燥金銀花1.00g于干燥錐形瓶中，按單因素考察和正交試驗設(shè)計各參數(shù)，設(shè)定超聲次數(shù)、超聲功率、料液比及乙醇濃度進(jìn)行提取。提取液經(jīng)補(bǔ)重后過濾，取續(xù)濾液。移取續(xù)濾液1mL至10mL容量瓶中，以水稀釋至刻度;取稀釋液1mL至10mL容量瓶中，按“1.2.2”下同法顯色，取稀釋液1mL至10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作參比[15]，于510nm波長處測定供試品溶液的吸光度，據(jù)回歸方程計算黃酮得率：

總黃酮提取率Y（%）=C×V×NM×1000×100%

式中，C指提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度（μg/mL），V指的是提取液的體積（mL），M為金銀花的質(zhì)量（g），N為稀釋倍數(shù)[16]。

1.2.4 單因素考察設(shè)計

超聲提取總黃酮影響較大的因素有料液比、超聲功率、超聲次數(shù)（時間）、乙醇濃度等，對上述4因素進(jìn)行單因素考察，具體如下。

1.2.4.1 料液比對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內(nèi)，設(shè)置超聲時間參數(shù)（超聲工作3s、間隔5s），以乙醇濃度為60%、超聲功率100W分別在料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70下工作100次（合超聲時間300s），分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.2 超聲次數(shù)（時間）對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內(nèi)，設(shè)置超聲時間參數(shù)（超聲工作3s、間隔5s），以乙醇濃度為60%、超聲功率100W、料液比為1∶40下分別工作40、60、80、100、120次，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內(nèi)，其它條件一致（料液比1∶40、乙醇濃度50%、超聲工作100次），用40、60、80、100、120W的超聲功率進(jìn)行提取，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.4 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內(nèi)，其它條件一致（料液比1∶40、超聲功率100W、超聲工作100次），用乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%進(jìn)行提取，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.5 正交試驗設(shè)計

在單因素考察的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交試驗，每組制備3個樣品待測，并對最優(yōu)組合進(jìn)行驗證，以期優(yōu)化超聲提取金銀花總黃酮的工藝條件（實(shí)驗因素水平及編碼設(shè)計見表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

根據(jù)“1.2.2”實(shí)驗結(jié)果，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=0.0123C-0.0082（R2=0.9995，n=7）（見圖1）。表明蘆丁對照品在15～65μg/mL范圍內(nèi)吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素考察試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對總黃酮得率的影響

料液比影響如圖2所示。隨著液體量的變化，金銀花總黃酮提取率受到顯著影響。由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶40時黃酮得率最大，料液比超過1∶40后，黃酮得率在下降，可能是由于液體量過大致使超聲的空化效應(yīng)減弱，對金銀花細(xì)胞的破碎受限，造成黃酮溶出減少。

2.2.2 超聲次數(shù)（時間）對總黃酮得率的影響

超聲次數(shù)影響如圖3所示。在超聲次數(shù)為40～120次即超聲時間為120～360s時，隨著超聲時間的延長金銀花總黃酮提取率在不斷升高，當(dāng)超聲次數(shù)超過100次時曲線變化不明顯，可能是長時間的超聲波熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)對黃酮的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞。

2.2.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

超聲功率影響如圖4所示。隨著超聲功率的增加，總黃酮提取率也在不斷上升，功率在40～80W坡線較陡，增長較快，可能因為隨著功率的增加，空化效應(yīng)增強(qiáng)，使得金銀花細(xì)胞破碎量增多，總黃酮的析出量增大。功率高于80W之后，雖然提取率還在增加，但是趨勢逐漸平緩，隨著超聲功率的逐漸升高，可能會破壞總黃酮結(jié)構(gòu)。另外，還可能使得金銀花中其它雜質(zhì)的析出增多，造成有效成分不易提純。故選120W為最佳。

2.2.4 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

乙醇濃度影響如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)乙醇濃度為50%時黃酮得率最大，超過50%后黃酮得率減小，可能是高濃度的乙醇限制了黃酮類化合物的溶出，致使其被阻隔在了細(xì)胞內(nèi)。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表2分析可知，極差最大的因素是超聲次數(shù)，其次是料液比和超聲功率，極差最小的是乙醇濃度，表明影響金銀花總黃酮得率的主次因素為超聲次數(shù)>料液比>超聲功率>乙醇濃度。由各因素水平可得最優(yōu)組合為A1B2C3D3，即在料液比為1∶30、乙醇濃度為50%、超聲功率為120W條件下超聲120次，測得此組合實(shí)驗金銀花總黃酮的提取率為18.83%。

3 討論

現(xiàn)代藥理研究明確金銀花在多種疾病的預(yù)防和治療方面卓有成效[17]，提高金銀花中有效成分的提取率可以為金銀花資源的高效可持續(xù)利用提供有力保障。本實(shí)驗采用超聲提取法并正交設(shè)計優(yōu)選出金銀花總黃酮的提取工藝參數(shù)，利用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量，優(yōu)化組合的總黃酮得率高達(dá)18.83%，相較于其它提取方法[11，12，18，19]有顯著提高。傳統(tǒng)的加熱回流提取工藝溫度過高，會破壞黃酮結(jié)構(gòu)，使有效成分的穩(wěn)定性降低。本法操作簡單，污染小，節(jié)約資源，經(jīng)濟(jì)方便，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，同時也為金銀花資源的高效開發(fā)利用提供參考依據(jù)。有學(xué)者創(chuàng)新性地提出通過靜電場來加強(qiáng)超聲波的空化效應(yīng)[20]，以期達(dá)到提高有效成分提取率的目的，此舉也為中藥材資源的高效開發(fā)利用提供了新思路。

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（責(zé)任編輯 李媛媛）