吳源陶　鄒譯嫻　王理槐

〔摘要〕 目的 本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測開心散活性成分的抗抑郁藥理作用機(jī)制。方法 通過TCMSP、ETCM獲取開心散的成分和靶點(diǎn)，運(yùn)用Genecard、OMIM篩選抑郁癥相關(guān)的蛋白，通過STRING構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用 Cytoscape進(jìn)行靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?、MCODE聚類分析，使用R語言進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，最后使用MOE軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)分析表明，開心散中25個(gè)活性成分與其發(fā)揮抗抑郁作用密切相關(guān)，該機(jī)制涉及到51個(gè)靶點(diǎn)（包括ACHE、HTR3A、DRD2等）以及24條通路;分子對(duì)接結(jié)果顯示化合物aposcopolamine、 perlolyrine、 hederagenin與PPARG、ACHE、SLC6A4、DRD2靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合能力。結(jié)論 開心散可能主要通過神經(jīng)活性受體配體相互作用、羥色胺突觸、cAMP通路等相關(guān)靶標(biāo)起到抗抑郁的功效，該研究為一步揭示開心散治療抑郁癥的潛在活性成分及其可能的作用機(jī)制提供了思路。

〔關(guān)鍵詞〕 開心散;抑郁癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

〔中圖分類號(hào)〕R277.7? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.012

Using Network Pharmacology Model to Explore the Mechanism of Kai-Xin-San in

Treating Depression

WU Yuantao， ZOU Yixian， WANG Lihuai*

（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chines Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To predict the anti-depressant pharmacological mechanism of Kai-Xin-San （KXS） active ingredients by network pharmacology. Methods The components and targets of KXS were obtained by TCMSP and ETCM， and the proteins related to depression were screened by Genecard and OMIM. The protein interaction network （PPI） was constructed by STRING. Topological attribute analysis and MCODE cluster analysis of the target were performed by Cytoscape. R language was performed to conduct GO and KEGG path enrichment analysis. Finally， MOE software was applied for molecular docking verification. Results Network analysis showed that the 25 active ingredients in KXS were closely related to its anti-depressant effect. The mechanism involved 51 targets （ACHE， HTR3A， and DRD2， etc.） and 24 pathways. The molecular docking showed that aposcopolamine， perlolyrine， and hederagenin had good docking activity with PPARG， ACHE， SLC6A4， and DRD2， respectively. Conclusion KXS may exert anti-depressant effects through pathway-related targets such as neuroactive receptor-ligand interactions， serotonin synapses， and cAMP pathways efficacy. This study provides an idea for the study of the potential active components of KXS in the treatment of depression and its possible mechanism of action.

〔Keywords〕 Kai-Xin-San; depression; network pharmacology

抑郁癥又稱抑郁障礙，是各種原因?qū)е碌囊环N心理障礙的精神疾病，臨床表現(xiàn)為情緒低落，興趣減低，精神不振，悲觀，思維遲緩，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)自殺行為，嚴(yán)重影響著人類的健康[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截止到2017年，全球范圍的抑郁癥患者高達(dá)3億多。有研究顯示，我國約20%人群出現(xiàn)抑郁癥狀，在疾病負(fù)擔(dān)排名第2位[1]。目前針對(duì)抑郁癥的治療主要是依靠氟西汀、文法拉辛等藥物，但這些藥物不良反應(yīng)以及單一成分發(fā)揮藥效使其應(yīng)用受到限制。而近年來，通過對(duì)中草藥的深入研究，發(fā)現(xiàn)了許多具有抗抑郁的天然藥物，中草藥憑借自身效果好、副作用少，越來越受到人們的青睞[2]。

在唐代孫思邈的《備急千金要方》中，記載著開心散（人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲）主治悲憂不樂、神志不寧、善忘等癥，而這些與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抑郁癥狀相一致[3]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，開心散可增加神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)的營養(yǎng)因子，從而緩解抑郁樣癥狀，在細(xì)胞中可以促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞合成與神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌[4]。但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，研究作用機(jī)制困難，而基于系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，以更省時(shí)省力的方式從整體水平上探討中藥與疾病之間的關(guān)系，為解釋中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整體機(jī)制提供了新的研究方式[5-6]。

本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究其治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制，為闡釋中藥復(fù)方作用機(jī)制提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1? 構(gòu)建開心散化學(xué)成分和預(yù)測靶點(diǎn)

從數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[7]、ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html ）收集開心散各單味藥的化學(xué)成分，并在TCMSP進(jìn)行篩選。

ADME指機(jī)體對(duì)外源化學(xué)物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion）一系列過程[8]。在這項(xiàng)研究中，我們選取ADME的3個(gè)相關(guān)的指標(biāo)：口服生物利用度（OB），血-腦屏障（BBB），和類藥性（DL），設(shè)置OB≥30%，BBB≥-0.3、DL≥0.18進(jìn)行化合物篩選。

1.2? 抑郁癥靶點(diǎn)的收集及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在OMIM（http：//omim.org/）[9]、Gencards（http：//www.

genecards.org/）[10]中輸入“Depression”，獲得相關(guān)的抑郁癥靶點(diǎn);同時(shí)將潛在治療靶基因輸入STRING（http：//stringdb.org/cgi/input.pl）[11-13]網(wǎng)站，設(shè)置物種為“人”和置信度分?jǐn)?shù)>0.4，獲得蛋白相互作用關(guān)系圖。

1.3? GO、KEGG富集

使用R語言對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）途徑富集分析。

1.4? 網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用Cytoscape（3.7.1）[13]的Network Analyzer分析中介中心度和節(jié)點(diǎn)度2個(gè)拓?fù)鋮?shù)、MCODE聚類分析。此外，通過Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，抑郁癥的成分-靶點(diǎn)-通路圖。

1.5? 分子對(duì)接

運(yùn)用Molecular Operating Environment（MOE 2015.10軟件）來驗(yàn)證化合物（aposcopolamine， perlolyrine， hederagenin）與部分靶蛋白之間的關(guān)系[13]。從蛋白數(shù)據(jù)庫-PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.RCSB.org/）獲取靶點(diǎn)PPARG（PDB ID： 6k0t）、ACHE（PDB ID： 1DX4）、SLC6A4（PDB ID： 5i6x）、DRD2（PDB ID： 3PBL）的3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)過對(duì)靶點(diǎn)原始結(jié)構(gòu)的預(yù)處理，最后保留靶點(diǎn)的活性區(qū)域。用MOE軟件中MOE-Dock模塊，將配體（化合物）與受體（靶點(diǎn)）進(jìn)行半柔性對(duì)接，通過得分值的高低和與氨基酸殘基結(jié)合的數(shù)目評(píng)價(jià)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1? 開心散成分分析

根據(jù)OB≥30%、BBB≥-0.3、DL≥0.18，我們共獲得開心散化合物31種，去除沒有靶點(diǎn)的成分后，得到25種活性成分（表1），其中2種源于石菖蒲，4種源于茯苓，17種源于人參，2種源于遠(yuǎn)志，并且基于TCMSP，得到53個(gè)開心散預(yù)測的靶點(diǎn)。

2.2? 開心散治療抑郁癥靶點(diǎn)的預(yù)測和PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對(duì)OMIM和GeneGard收集的抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)去重，獲得9 274個(gè)相關(guān)的靶點(diǎn)。通過與開心散預(yù)測的靶點(diǎn)匹配，獲得51個(gè)潛在治療抑郁癥靶點(diǎn)。將51個(gè)潛在治療靶點(diǎn)輸入STRING，得到由49個(gè)節(jié)點(diǎn)和228條邊構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。根據(jù)介度中心性（BC）確定關(guān)鍵分子，其中ACHE（BC=0.160）、PTGS2（BC=0.144）、HTR3A（BC=0.141）、NR3C1（BC=0.124）、DRD2（BC=0.099）排名靠前。

2.3? GO和KEGG富集分析

GO分析中，生物過程（BP）得到 405 個(gè)條目，細(xì)胞組成（CC）得到56個(gè)條目，分子功能（MF）有 88個(gè)條目，分別取前20個(gè)繪制柱狀圖（圖2）。在生物過程分析中，排名前五的是腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路（GO：0007188），G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)（GO：0007187）， 腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路（GO：0071880），血液循環(huán)（GO：0008015），循環(huán)過程（GO：0003013）;在細(xì)胞組成分析中，主要涉及突觸后膜、突觸前膜、突觸等;在分子功能中，主要有G-蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素受體、兒茶酚胺、神經(jīng)遞質(zhì)受體、類固醇激素受體等參與。KEGG通路富集分析顯示共24條通路，取前20條通路繪制 KEGG氣泡圖（圖3）。從圖中可看出治療抑郁癥的常見的通路：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號(hào)通路、5-羥色胺能神經(jīng)突觸、鈣信號(hào)通路和膽堿能突觸、多巴胺能突觸等。

2.4? 網(wǎng)絡(luò)分析

開心散治療抑郁癥的“成分-靶點(diǎn)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。該網(wǎng)絡(luò)有102個(gè)節(jié)點(diǎn)，374條邊，密集的連線顯示開心散的多個(gè)成分通過多個(gè)目標(biāo)與治療抑郁癥途徑相關(guān)聯(lián)，揭示開心散多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療作用。

2.5? 分子對(duì)接

如圖5所示，開心散3種潛在活性化合物（aposcopolamine、perlolyrine、hederagenin）與靶點(diǎn)PPARG、ACHE、SLC6A4、DRD2中的氨基酸殘基結(jié)合主要以分子間的氫鍵為主，分子間的氫鍵是較為重要的穩(wěn)定作用力，可使得配體與受體之間結(jié)合更加穩(wěn)定，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控蛋白的作用[14]。由此說明，開心散的主要特征性化學(xué)成分與PPARG、ACHE、SLC6A4、DRD2靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合能力。

3 討論

開心散中人參補(bǔ)益元?dú)猓菫榫?臣藥茯苓養(yǎng)心安神;佐藥遠(yuǎn)志，寧心化痰;使藥石菖蒲，具有益智醒神和引藥入經(jīng)功效[8]。劉麗琴等[15]發(fā)現(xiàn)人參中的主要成分人參皂苷能改善慢性應(yīng)激所致的大鼠抑郁行為;此外，人參皂苷 Rg1、Rb1、Re、Rg3等都具有一定的抗抑郁作用[16]。遠(yuǎn)志中的皂苷類、寡糖酯類化合物具有抗氧化、抗抑郁作用[17]。胡霜等[18]通過懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石菖蒲具有一定的抗抑郁作用;茯苓具有鎮(zhèn)靜、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[19]。這些研究表明，開心散活性成分具有抗抑郁，抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等作用，而且該方可能主要通過人參中而且該方的人參皂苷可能是主要發(fā)揮療效的成分。發(fā)揮其抗抑郁療效。

預(yù)測結(jié)果顯示ACHE、HTR3A、DRD2可能是潛在的核心靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果亦證實(shí)，開心散可能作用于 ACHE、DRD2靶點(diǎn)。乙酰膽堿酯酶（AChE）在神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生起到重要作用。張曉杰等[20]發(fā)現(xiàn)抑郁癥模型中AChE活性升高，并且隨著年齡的增長而升高。在一項(xiàng)前瞻性縱向研究中，色胺（5-HT）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可以緩解應(yīng)激性生活事件對(duì)抑郁的影響[21]。多巴胺（DA）參與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，抑郁動(dòng)物體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率明顯增加[22]。綜合分析表明，開心散可能通過調(diào)節(jié)這些靶點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，羥色胺突觸有7個(gè)靶點(diǎn)，分別是PTGS2、PTGS1、MAOB、MAOA、HTR3A、SLC6A4、CACNA1S，其中SLC6A4靶基因經(jīng)分子對(duì)接證實(shí)與開心散有靶向關(guān)系。Dong等[23]發(fā)現(xiàn)，開心散可以通過增加關(guān)鍵酶TPH的蛋白質(zhì)mRNA的表達(dá)，從而使5-HT在大腦和突觸間隙的含量升高，發(fā)揮抗抑郁作用。王石等[24]發(fā)現(xiàn)開心散對(duì)體外MAOA和MAOB的活性均有一定的抑制作用。PTGS2、PTGS1調(diào)節(jié)抑郁癥中的炎癥介質(zhì)，而cAMP通路可以促進(jìn)NGF與BDNF表達(dá)。臨床研究表明，抑郁癥患者血清中神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF與BDNF 均有均顯著下降[25]。此外，神經(jīng)活性受體-配體相互作用通路、鈣信號(hào)通路、膽堿能突出通路等通過調(diào)節(jié)多巴胺受體、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸受體、乙酰膽堿受體、5-HT受體、糖皮質(zhì)受體等靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁的功效。

綜上所述，本文通過構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理研究模式進(jìn)行開心散抗抑郁的研究。分析發(fā)現(xiàn)，開心散中有潛在25個(gè)藥物活性成分共涉及51個(gè)靶標(biāo)，24條通路，預(yù)測結(jié)果表明開心散可能通過作用于羥色胺突觸、cAMP通路、神經(jīng)活性受體配體相互作用等通路發(fā)揮抗抑郁作用。本研究雖然采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法對(duì)開心散抗抑郁的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、作用機(jī)制做了預(yù)測分析，但是其進(jìn)一步的機(jī)制研究還需要通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)來進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 周芯蕾，閆? 芳.1999-2017年抑郁癥領(lǐng)域科技成果項(xiàng)目分析[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2019，35（7）：777-782.

[2] 姚? 媛，周? 藝，周婷婷.抑郁癥致病機(jī)制及中藥治療抑郁癥的機(jī)制研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2018，36（3）：193-197.

[3] ZHU Y， DUAN X， CHENG X， et al. Kai-Xin-San， a standardized traditional Chinese medicine formula， up-regulates the expressions of synaptic proteins on hippocampus of chronic mild stress induced depressive rats and primary cultured rat hippocampal neuron[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2016，193：423-432.

[4] 曹? 程，肖鈞元，劉夢(mèng)秋，等.中藥復(fù)方開心散調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2018，20（6）：847-855.

[5] 高? 耀，吳? 丹，田俊生，等.逍遙散和開心散“同病異治”抑郁癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制研究[J].中草藥，2018，49（15）：3483-3492.

[6] LI X J， ZHANG H Y. Synergy in natural medicines： implications for drug discovery[J]. Trends in Pharmacol Sciences， 2008，29（7）：331-332.

[7] RU J， LI P， WANG J， et al. TCMSP： a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of Cheminformatics， 2014，6：13.

[8] 時(shí)? 悅，姚瓔珈，藺? 瑩，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的開心散治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（9）：1458-1466.

[9] AMBERGER J S， HAMOSH A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）： A Knowledgebase of Human Genes and Genetic Phenotypes[J]. Current Protocols in Bioinformatics， 2017，58：1-2.

[10] STELZER G， ROSEN N， PLASCHKES I， et al. The GeneCards Suite： From Gene Data Mining to Disease Genome Sequence Analyses[J]. Current Protocols in Bioinformatics， 2016，54：1-30.

[11] SZKLARCZYK D， FRANCESCHINI A， WYDER S， et al. STRING v10： protein-protein interaction networks， integrated over the tree of life[J]. Nucleic Acids Research， 43（D1）：D447-D452.

[12] 周? 鵬，楊建澳，許繼公，等.基于分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測苓桂術(shù)甘湯防治慢性心力衰竭的作用機(jī)制[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，41（4）：82-87.

[13] SHANNON P， MARKIEL A， OZIER O， et al. Cytoscape： a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Research， 2003，13（11）：2498-2504.

[14] HE D， HUANG J H， ZHANG Z Y， et al. A Network Pharmacology-Based Strategy For Predicting Active Ingredients And Potential Targets Of LiuWei DiHuang Pill In Treating Type 2 Diabetes Mellitus[J]. Drug Design Development and Therapy， 2019，

13：3989-4005.

[15] 劉麗琴，羅? 艷，張瑞睿，等.人參皂苷對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及HPA軸、BDNF的影響[J].中國中藥雜志，2011，36（10）：1342-1347.

[16] 任思宇，王真真，陳乃宏.人參皂苷抗抑郁作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（12）：2204-2208.

[17] 章主恒，王? 靜，付? 宇，等.中藥遠(yuǎn)志抗抑郁有效成分及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2018，24（12）：1797-1801.

[18] 胡? 霜，馬義澤.石菖蒲等五味中藥抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 山東中醫(yī)雜志，2009，28（11）：799-800.

[19] 溫智林，王真真，賀文彬，等.開心散及其有效成分抗抑郁作用的研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26（3）：420-423.

[20] 張曉杰，興桂華，董海影，等.不同年齡組抑郁癥模型大鼠腦乙酰膽堿酯酶及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性的變化[J].中國老年學(xué)雜志，2012，

32（6）：1191-1193.

[21] CASPI A， SUGDEN K， MOFFITT T E， et al. Influence of life stress on depression： moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene[J]. Science， 2003，301（5631）：386-389.

[22] LI Z， HE Y， TANG J， et al. Molecular imaging of striatal dopamine transporters in major depression-a meta-analysis[J]. Journal of Affective Disorders， 2015，174：137-143.

[23] DONG X Z， LI Z L， ZHENG X L， et al. A representative prescription for emotional disease， Ding-Zhi-Xiao-Wan restores 5-HT system deficit through interfering the synthesis and transshipment in chronic mild stress-induced depressive rats[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2013，150（3）：1053-1061.

[24] 王? 石，董憲喆，譚? 瀟，等.開心散對(duì)單胺氧化酶活性的影響[J]. 中國中藥雜志，2016，41（10）：1898-1902.

[25] ALFONSO J， FRICK L R， SILBERMAN D M， et al. Regulation of hippocampal gene expression is conserved in two species subjected to different stressors and antidepressant treatments[J]. Biological Psychiatry， 2006，59（3）：244-251.

〔收稿日期〕2019-10-17

〔基金項(xiàng)目〕湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（18C0373）;湖南省衛(wèi)生健康委科研課題（20191304）。

〔作者簡介〕吳源陶，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治內(nèi)分泌疾病。

〔通訊作者〕*王理槐，男，主治醫(yī)師，E-mail：510236274@qq.com。