陳立浩　時健　劉倩宏　姚小磊　蔣鵬飛

〔摘要〕 目的 考察菊花總黃酮治療去勢雄兔干眼的具體機制。方法 采取隨機數(shù)字法將150只雄兔分為15組，編號分別為A1、A3、A5、B1、B3、B5、C1、C3、C5、D1、D3、D5、E1、E3、E5，每組10只，A-E組中序號對應(yīng)干預(yù)時間，其中A組不做任何干預(yù)處理，B組行假去勢術(shù)，C、D、E組行雙側(cè)去勢術(shù)建立雄激素水平缺乏型干眼模型。A、B、C組均用生理鹽水灌胃，D組行雄激素（丙酸睪酮）肌肉注射，E組用菊花總黃酮灌胃。分別于治療后的1、3、5月，將動物處死。觀察：（1）雄激素樣效應(yīng) 以免疫組織化學(xué)法測定淚腺組織中雄激素受體（androgen receptor，AR）光密度，輔以RT-PCR技術(shù)測定AR mRNA表達，以觀察淚腺組織中AR上調(diào)情況;（2）細胞凋亡 以RT-PCR技術(shù)測定淚腺中細胞凋亡相關(guān)基因蛋白Bax mRNA的表達;（3）形態(tài)學(xué)改變 使用透射電鏡觀察淚腺超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 （1）雄激素樣效應(yīng)：E組與C組相比，其淚腺組織中AR明顯上調(diào)（P<0.01），AR mRNA表達率明顯增長（P<0.01）;（2）細胞凋亡：E組Bax mRNA表達率與C組比較下降明顯（P<0.01）;（3）形態(tài)學(xué)改變：E組在干預(yù)后，線粒體腫脹減輕，丟失或成空泡變，而C組線粒體腫脹，局灶凋亡壞死，凋亡明顯。結(jié)論 菊花總黃酮具有較好的雄激素樣效應(yīng)，能夠抑制Bax mRNA凋亡，恢復(fù)淚腺組織形態(tài)。它將有望應(yīng)用于由雄激素水平下降所致干眼的臨床治療中。

〔關(guān)鍵詞〕 干眼;去勢雄兔;菊花總黃酮;雄激素樣效應(yīng);Bax mRNA;形態(tài)學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5;R777.2+1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.005

Effects of Total Flavonoids from Chrysanthemum on AR， AR mRNA， Bax mRNA and Morphology in Lacrimal Gland of Castrated Dry Eye Male Rabbits

CHEN Lihao1，2， SHI Jian1， LIU Qianhong1， YAO Xiaolei3*， JIANG Pengfei1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the specific mechanism of total flavonoids from chrysanthemum in the treatment of castrated male rabbit dry eyes. Methods A total of 150 male rabbits were randomly divided into 15 groups with random number method， and numbered A1， A3， A5， B1， B3， B5， C1， C3， C5， D1， D3， D5， E1， E3， E5， with 10 rabbits in each group. There was no intervention in group A. Sham castration was given in group B. Bilateral castration was performed in groups C， D and E. Group A， B and C were given normal saline. Group D was given testosterone propionate intramuscular injection， and group E was given total flavonoids of chrysanthemum by gavage. The animals were killed 1， 3 and 5 months after treatment. （1） For the observation of androgen like effect，androgenreceptor（AR） density in lacrimal gland was measured by immunohistochemistry， and AR mRNA expression was measured by RT-PCR to observe the up-regulation of AR in lacrimal gland. （2） For the observation of apoptosis， Bax mRNA expression in lacrimal gland was measured by RT-PCR. （3） For the observation of morphological changes， ultrastructural structural changes of lacrimal gland were observed by transmission electron microscopy. Results （1） androgen like effect： compared with the model group C， the AR in lacrimal gland of group E was significantly up-regulated （P<0.01）， and the AR mRNA expression rate was significantly increased （P<0.01）. （2） Apoptosis： the Bax mRNA expression rate of group E was significantly decreased （P<0.01） compared with that of group C. （3） Morphological changes： after the intervention， the swelling of mitochondria in Group E was reduced， and the mitochondria in group C were lost or vacuolized， whilethe swelling of mitochondria， focal apoptosis and necrosis in group C was obvious. Conclusion The total flavone from chrysanthemum has a better androgen like effect， which can inhibit Bax mRNA apoptosis and restore lacrimal gland morphology. It is expected to be used in the clinical treatment of dry eye caused by the decrease of androgen level.

〔Keywords〕 dry eye disease; castrated male rabbit; total flavones from chrysanthemum; androgen-like effect; Bax mRNA;morphology

干眼是一種以眼睛干澀感為主要癥狀的眼科疾病。本病發(fā)病率很高，占眼科門診量的30%以上[1]，這引起社會的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代研究認為，老年尤其是女性可因機體內(nèi)部雄激素水平下降而導(dǎo)致干眼[2-3]。部分中藥可替代激素治療干眼，且副作用較后者低，在干眼治療領(lǐng)域前景廣闊。相關(guān)研究已經(jīng)證實密蒙花提取物具備擬雄激素效應(yīng)，可治療因激素水平下降誘發(fā)的干眼。例如密蒙花總黃酮[4-7]及在此研究基礎(chǔ)上密蒙花提取物滴眼液[8-14]、密蒙花顆粒劑[15-17]等相關(guān)研究均為此提供了相關(guān)證據(jù)。為擴大替代激素的中藥提取物的可選擇性，開發(fā)新的干眼臨床藥物，基于菊花可清肝明目的中醫(yī)學(xué)認知，本課題組對杭白菊的提取物——菊花總黃酮進行研究。本次實驗旨在從雄激素受體（androgen receptor，AR）、Bax mRNA、淚腺組織形態(tài)學(xué)3個方面，進一步探究菊花總黃酮治療雄激素水平下降所致干眼的機制。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗對象? 實驗動物選取2月齡健康雄兔150只（品種為日本大耳白兔，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號：2012-0361，SPF級，遠交系），體質(zhì)量：2～2.5 kg。

1.1.2? 實驗藥物? 杭白菊總黃酮（生產(chǎn)批號：JH130804，產(chǎn)自蘇州工業(yè)技術(shù)研究院，用80%濃度的乙醇溶液提取，并經(jīng)大孔樹脂純化制得，總黃酮質(zhì)量分數(shù)為8.55%），配成濃度為1.80 mg/mL。

1.1.3? 試劑與耗材? 蘆丁試劑（成都曼斯特生物科技有限公司），Trizol（日本TAKARA公司），免疫組織化學(xué)試劑盒、顯色劑、RNA酶抑制劑RNasin（來源于大腸桿菌表達的鼠源基因）、多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司），氯仿、異丙醇（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.1.4? 主要實驗設(shè)備? Shandon 325 型石蠟切片機（英國Shandon公司），Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司），TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），iQ5 Real-Time PCR Detection System （美國Bio-Rad公司），日立H-600透射式電子顯微鏡（上海百賀儀器科技有限公司）。

1.1.5? AR引物? 從NCBI中檢索基因序列信息（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank; provided in the public domain by the National Center for Biotechnology Information， Bethesda， MD），并利用primer5軟件設(shè)計引物。引物來源于日本Takara公司。正向鏈：5′-TCCACCTCCTCCAAGGACAGT-3′，反向鏈：5′-CCAA？鄄CGCCTCCACACCCAA-3′;β-actin：正向鏈：5′-TCCTTCCTGGGCATGGAGTC-3′，反向鏈：5′-GGATGTCCACGTCGCACTTC-3′;Bax引物：正向鏈：5′-CGAGTGTCTCCGGCGAATTG-3′，反向鏈：5′-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3′。擴增引物長度分別為56 bp、152 bp、48 bp。

1.2? 方法

1.2.1? 動物及分組? 取健康2月齡雄性日本大耳白兔150只，采取隨機數(shù)字法將其分為A1、A3、A5、B1、B3、B5、C1、C3、C5、D1、D3、D5、E1、E3、E5共15組，每組10只。A、B、C、D、E分別代表正常組、假手術(shù)組、模型組、雄激素對照治療組和菊花總黃酮治療組，1、3、5分別代表干預(yù)1、3、5個月。

1.2.2? 干眼模型的建立? 采用去勢方法對雄性日本大耳白兔進行造模[15]。A組為空白組，不做特殊處理;B組行假去勢術(shù)作為對照，只切開陰囊，不切除睪丸;C、D、E組行雙側(cè)睪丸切除術(shù)（ORX），切除雄兔的雙側(cè)睪丸及附睪。去勢后飼養(yǎng)1月、3月、5月分別表示建立輕度、中度、重度干眼模型。

1.2.3? 干預(yù)方法? 造模手術(shù)后1周開始干預(yù)。A、B、C組以生理鹽水按5 000 mg/kg灌胃，每日1次;D組以1∶4麻油稀釋后的雄激素（丙酸睪酮注射液）按500 mg/kg大腿肌肉注射，每3日1次;E組以1%菊花總黃酮混懸液（杭白菊總黃酮63.6 mg溶解于生理鹽水10 mL）按5 g/kg灌胃，每日1次。A-E組中序號對應(yīng)相應(yīng)的干預(yù)時間，1、3、5組分別灌胃1、3、5個月。實驗過程中，使用常規(guī)飼料喂養(yǎng)雄兔。

1.2.4? 取材? 處死動物（采用靜脈空氣注射法），并即刻摘除淚腺。將淚腺剪為3份：一份4%多聚甲醛保存、常規(guī)石蠟包埋，并利用石蠟切片機連續(xù)切片，適用于免疫組織化學(xué)方法檢測;一份低溫保存，用于RT-PCR檢測;一份戊二醛保存，供電鏡觀察用。

1.2.5? 檢測指標? （1）免疫組織化學(xué)法測定雄兔淚腺組織中雄激素受體（androgen receptor，AR）光密度。將淚腺組織的石蠟切片脫臘至水，使用蒸餾水洗滌（2 min×2次）。按照武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的免疫組化染色劑試劑盒說明書進行操作。染色成功后，使用免疫組化測量軟件系統(tǒng)進行測量及半定量分析：隨機統(tǒng)計各組5～7個高倍視野中AR數(shù)值，以該值除以組數(shù)，結(jié)果即為AR的平均光密度值。系統(tǒng)參數(shù)：像素點長2.105 μm，窗口面積1.271×106 μm2。（2）RT-PCR法測定AR mRNA、Bax mRNA的表達。檢測AR mRNA：取冷凍組織100 mg提取總RNA，濃度調(diào)為1 μg/μL;將2 μg總RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;取其于40 μL反應(yīng)體積（10×Buffer 4 μL、dNTP 0.8 μL、MgCl2 3.2 μL、5 U/μL TaqDNA多聚酶 0.3 μL、模板4 μL、上下游引物各0.3 μL、去離子水27.1 μL）中進行PCR反應(yīng)，熱循環(huán)運行參數(shù)為AR：93 ℃ 3 min，進入循環(huán)，93 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s;29個循環(huán)，72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 3 min，進入循環(huán)，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s;29個循環(huán)后，72 ℃ 5 min;擴增后顯影、攝影，以AR mRNA光密度值與β-actin mRNA光密度值的相對比值為AR mRNA的相對表達量。Bax mRNA的檢測及分析方法同上。（3）透射電鏡檢測淚腺組織形態(tài)學(xué)的變化。將淚腺組織從戊二醛固定液中取出后，以PBS漂洗3次，再以1%鋨酸后固定，透射電鏡觀察淚腺超微結(jié)構(gòu)變化。

[3] UCHINO M， YOKOI N， UCHINO Y， et al. Prevalence of dry eye disease and its risk factors in visual display terminal users： the Osaka study[J]. American Journal of Ophthalmology， 2013， 156（4）：759-766.

[4] 李懷鳳，彭清華，姚小磊，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥模型角膜和淚腺組織中TNF-α，IL-1β表達的影響[J].國際眼科雜志，2009，9（7）：1248-1251.

[5] 陳佳文，彭清華，姚小磊，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥淚腺TGF-β1及其基因表達的影響[J].眼科研究，2010，28（4）：311-314.

[6] 姚小磊，彭清華，吳權(quán)龍.密蒙花提取物治療兔去勢所致干眼癥[J].眼視光學(xué)雜志，2008，10（1）：21-26.

[7] 李懷鳳，彭清華，姚小磊，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥模型角膜和淚腺組織的保護作用[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2010，20（1）：1-6.

[8] 彭清華，姚小磊，吳權(quán)龍，等.密蒙花提取物滴眼劑對實驗性干眼癥大鼠淚腺組織細胞凋亡的影響（英文）[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2010，8（3）：244-249.

[9] 彭? 俊，歐陽云，譚涵宇，等.密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（5）：469-472.

[10] 張又瑋，覃艮艷，彭曉芳，等.密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼淚腺組織中ICAM-1、IL-6、IL-17表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，39（4）：448-452.

[11] 彭清華，姚小磊，彭? 俊，等.密蒙花提取物對干眼癥雄兔淚腺局部炎癥反應(yīng)影響的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（7）：1351-1356.

[12] 吳權(quán)龍，彭清華，姚小磊，等.密蒙花提取物滴眼劑對實驗性干眼癥大鼠淚腺組織形態(tài)學(xué)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，29（5）：22-25.

[13] 彭清華，姚小磊，彭? 俊，等.密蒙花提取物滴眼劑對實驗性干眼癥鼠淚腺組織細胞凋亡的影響[J].國際眼科雜志，2010，10（1）：40-43.

[14] 王? 芬，彭清華，李海中，等.密蒙花總黃酮含藥血漿對干眼癥細胞模型Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表達的影響[J].國際眼科雜志，2012，12（10）：1836-1840.

[15] 歐陽云，彭? 俊，彭清華，等.密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺細胞凋亡因子Bax、Bcl-2、Fas和FasL的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（7）：858-862.

[16] 彭? 俊，歐陽云，譚涵宇，等.密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺細胞TNF-α及IL-1β表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（3）：874-877.

[17] 蔣鵬飛，彭? 俊，彭清華.密蒙花顆粒對去勢誘導(dǎo)的干眼癥兔淚腺細胞IL-12及IL-6的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，42（6）：477-482.

[18] 姚小磊，彭清華，陳啟雷，等.菊花總黃酮對去勢導(dǎo)致干眼癥雄兔淚腺細胞Fas、FasL表達的影響[J].國際眼科雜志，2014，14（10）：1749-1754.

[19] 姚小磊，彭清華，陳啟雷，等.菊花總黃酮對去勢導(dǎo)致雄兔干眼癥淚腺細胞Bax、Bcl-2表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，34（7）：12-17.

〔收稿日期〕2019-12-30

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（81260550）;國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)眼科學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目（ZK1801YK015）;中醫(yī)藥防治五官科疾病湖南省重點實驗室建設(shè)項目（2017TP1018）;湖南省中醫(yī)五官科學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目;湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科項目。

〔作者簡介〕陳立浩，男，在讀碩士研究生，研究方向：眼表與淚液疾病。

〔通訊作者〕*姚小磊，男，主任醫(yī)師，副教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yxlshh@126.com。